Vk com id2: Александра Владимирова ВКонтакте, id2

Я использую эти 2 метода взаимозаменяемо для подмножества данных из фрейма данных в R. Способ 1 subset_df <- df[which(df$age>5) , ] Способ 2 subset_df <- subset(df, age>5) У меня было 2…

Дан фрейм данных df со столбцами d , c , v . Как найти значение d для максимального значения v среди подмножества записей, где c == foo ? Я попробовал это: df[df$v==max(df$v) & df$c == foo,d] Но…

Я пытаюсь заменить значения столбца (кластера) для подмножества строк (значение < 6) внутри фрейма данных значениями вектора. df <- structure(list(value = c(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10),…

Я хочу удалить столбец 18 при создании подмножества из большего фрейма данных sub1 <- subset(dt6,ID == 51282 & [,-18]) dt6 — это более крупное подмножество. Я не могу удалить столбец 18 по…

У меня есть столбец в моем файле csv, который содержит Кортеж в качестве значения. E.g. Одно значение : 10.000 , 20.000 Моя цель состоит в том, чтобы разделить и заменить колонку двумя новыми…

Мне нужно изменить значения Индекса данного фрейма данных ( fruits.df ) с датами другого фрейма данных ( date.index ). Пример Данных: # fruits.df x <- 1:5 y <- 1:12 z <- 1:16 w <- 1:7…

Я хотел бы разделить один столбец на два внутри кадра данных at на основе разделителя. Например, METHAMPHETAMINE | MORPHINE THC чтобы стало METHAMPHETAMINE MORPHINE THC внутри фрейма данных….

У меня есть список фреймов данных, каждый из которых назван в честь пациента ID. df.list <- (1297, 2468, 3323, 4453, 4785, 6489, 7338, 8244, 9345, etc.) Каждый фрейм данных имеет такие данные…

Я изучаю python и pandas и испытываю трудности с преодолением ошибки при попытке подмножества фрейма данных. У меня есть фрейм входных данных: df0- Index Group Value 1 A 10 2 A 15 3 B 20 4 C 10 5 C…

Предположим, что A имеет df : df <- data.frame(A = 1 : 3, B = 2 : 4, C = 3 : 5, D = 4 : 6) Теперь я хочу удалить столбец A из df , как меня учили использовать subset ting: df <- df[, c(B, C,…

Правильное формирование сообщений для рассылки :: Пиаро

Правильное составление сообщений играет самую важную роль при рассылке сообщений.

А так как многие пользователи по какой-то причине считают что можно рассылать одно и то-же сообщение много раз и к ним не будет применено никаких санкций — сегодня хотелось бы описать основные правила по составлению сообщений для рассылки.

Поэтому если Вы хотите продуктивно заниматься рассылками — при составлении сообщений следует руководствоваться следующими правилами:

1. Нужно максимально «рандомизировать» сообщение

Рандомизация текста (тела письма) — это использование динамических участков текста, которые меняются при каждом использовании текста.

Рандомизация текста может происходить множеством вариантов:

• синонимизаций
• перестановкой
• использованием тегов

1.1. Синонимизация

Под синонимизацией подразумевается использование нескольких вариантов одного и того-же участка в сообщениях.

{Привет|Даров|Дрям|Приветики|Ку}, {как дела?|чё творишь?|давно не списывались!}

Результат:

• Привет, чё творишь?
• Приветики, как дела?
• Дрям, давно не списывались!

1.2. Перестановка

Перестановка это выставление перечня слов в случайном порядке.

Привет. Сегодня просто [+, +офигительная|охренённая|тёплая] и солнечная погода!

Результат:

• Привет. Сегодня просто охренённая, офигительная, тёплая и солнечная погода!
• Привет. Сегодня просто тёплая, охренённая, офигительная и солнечная погода!
• Привет. Сегодня просто офигительная, тёплая, охренённая и солнечная погода!

1.3. Теги

Теги позволяют устанавливать на место «спец. слов» вида %tag% — данные которые закреплены за данным тегом.

%hello%, %name%! Это твоя страница http://vk.com/id%id%?

Результат:

• Приветики, Сеня! Это твоя страница http://vk.com/id2?
• Прив, Лёш! Это твоя страница http://vk.com/id1?
• Ку, Машунь! Это твоя страница http://vk.com/id3?

Подробнее о поддерживаемых тегах можно прочитать в Базовом FAQ.

2. Сообщение должно состоять хотя-бы из 15-25 слов

Данное правило связано напрямую с предыдущим правилом, и связано с тем что чем больше слов — тем больше различных вариантов теста получится.

3. Нужно составлять сообщения «от людей — для людей»

Если Вы будете слать откровенный спам и пользователи будут жать «Это спам» — сообщение будут блокироваться в дальнейшем, а к аккаунтам которые будут рассылать данные сообщения могут быть применены санкции.

4. Необходимо избегать «стоп-слов»

Если Вы сами когда-либо получали СПАМ то знаете что чаще всего в рассылках одного и того-же спамера используется перечень одни и тех-же слов которыми пытаются привлечь внимание пользователя.

Так вот слов подобного рода, которые можно однозначно сразу приписать к спам рассылкам — следует избегать.

Например раньше были популярны рассылки вида:

Отправь СМС — получи деньги.

И теперь чаще всего если в Вашем сообщении будут одновременно 2 слова: СМС и деньги — сообщение попадёт в бан.

Так что следует избегать подобных слов: СМС, деньги, рассылки, спам, голоса, смотри на стене и т.д. и т.п.

4. Не использовать ссылки

Если вы шлёте ссылки — немедленно перестаньте!

Или же используйте большую (а точнее даже — огромную) базу разных ссылок, с разных доменов. Потому что через некоторое время ссылки — заносятся в «стоп-список», и при любом упоминании данной ссылки — сообщение будет заблокировано а к аккаунту могут быть применены санкции.

5. Распределяйте ссылки по потокам

Если же вы всё-таки шлёте ссылки — распределяйте ссылки по потокам соответствующей функцией в программе, для того чтоб одна и та же ссылка не использовалась разными аккаунтами.

Это поможет в случае блокировки ссылки — избежать блокировок всех аккаунтов которые использовали данную ссылку.

ID2 — обзор | ScienceDirect Topics

Роль регуляции miRNA и метилирования ДНК в механизмах полового старения человека на основе специфического основного GEN пожилых женщин

Анализ гендерно-специфических механизмов старения на основе определенного основного GEN пожилых женщин продемонстрировал, что DDIT3, MAX, TAOK3, TRAF6, MAP2K3, MAPKAPK2, RPS6KA5 и FOS участвуют в сигнальном пути MAPK (рис. 11.22). Семейство MAPK играет важную роль в сложных клеточных программах, таких как пролиферация, дифференцировка, развитие, трансформация и апоптоз [126].

Кроме того, TRAF6, MAP2K3, MYD88, TLR9 и FOS участвуют в сигнальном пути TLR. TLR играют важную роль в активации врожденного иммунитета, распознавая специфические паттерны микробных компонентов [127]. Стимуляция различных TLR вызывает различные паттерны экспрессии генов, которые не только приводят к активации врожденного иммунитета, но также определяют развитие антиген-специфического приобретенного иммунитета [128].

Внеклеточные и внутриклеточные стимулы через сигнальные пути MAPK и TLR приводят к активации FOS и DDIT3 и приводят к различным клеточным ответам за счет регуляции транскрипции его генов-мишеней (рис.11.22). TF FOS может активировать ген IL8 ( b _ij = 1,136866). IL8 участвует в ряде клеточных функций иммунной системы, клеточной пролиферации, клеточной коммуникации, клеточном транспорте, биологической регуляции и ответе на различные стимулы. Кроме того, TF DDIT3 может активировать многие гены-мишени, включая IL8 ( b _ij = 1,143526) и ID2 ( b _ij = 0.458447). Функции ID2 включают метаболизм и биологические регуляции.

Накопление мутаций играет ключевую роль в процессе старения, и было показано, что мутация MAX связана с наследственной феохромоцитомой [129], тогда как мутация MYD88, как было обнаружено, связана со многими гематологическими злокачественными новообразованиями [130]. Мы обнаружили, что экспрессия этих двух генов значительно различается у молодых и старых людей ( p <0,05), что подтверждает приведенные выше результаты.

Кроме того, мы обнаружили, что пять конкретных генов, MAX, TAOK3, MYD88, IL8 и ID2 , имеют различные базальные уровни экспрессии (т. Е. k _i в уравнении 11.14 отличаются) между молодыми и пожилыми женщинами, что в основном связано с метилированием ДНК соответствующих генов. Сообщалось, что метилирование ДНК и уровни экспрессии этих пяти генов значительно различаются между опухолевыми и нормальными образцами ( p <0,05; через MethHC) [124], что подтверждает наши результаты.Кроме того, TAOK3 и TRAF6 ингибируются МИР-141 ( c _il = −0,2235- TAOK3 ; c _il = −0,36144-09 TRAF6) мир-373 ( c _il = −0,10454- TAOK3 ; c _il = −0,12645- TRAF6 ). Мутации в этих генах, ингибирование miRNA и метилирование ДНК появляются только в специфическом ядре GEN у пожилых женщин.Кроме того, сообщалось, что DDIT3, MAX и FOS являются генами человека, связанными со старением (рис. 11.22; база данных GenAge). Других генов, связанных со старением, в нашем анализе не выявлено.

ТФ FOS и DDIT3 могут активироваться широким спектром стрессовых сигналов в процессе старения женщины, включая сигнальные пути MAPK и TLR, что приводит к различным клеточным ответам, включая иммунную активацию, пролиферацию клеток, метаболизм, межклеточную коммуникацию, клеточный транспорт, биологическая регуляция и ответ на различные раздражители.Если эти TF не активируются в процессе старения, врожденная иммунная система становится нерегулируемой, что характеризуется стойкими воспалительными ответами, в которых участвуют несколько типов иммунных и неиммунных клеток. Это приводит к размножению аномальных или мутировавших клеток и увеличению случаев онкогенеза. В процессе старения в организме накапливается множество опухолей. Кроме того, с возрастом многие метаболические пути снижаются, и это является серьезным следствием процесса старения, который вызывает предрасположенность к ряду заболеваний.Следовательно, препараты, предназначенные для IL8, ID2, TRAF6 или TAOK3 , могут улучшить процесс старения у женщин.

Id-белки Id1 и Id2 селективно ингибируют связывание ДНК одним классом белков спираль-петля-спираль.

Mol Cell Biol. 1991 Nov; 11 (11): 5603–5611.

Институт биомедицинских исследований Уайтхеда, Кембридж, Массачусетс 02142.

Abstract

Активность связывания ДНК некоторых основных областей и предполагаемых факторов транскрипции, содержащих спираль-петля-спираль (bHLH), может подавляться белком Id.Поскольку Id содержит мотив HLH для димеризации, но не основной аминокислотный участок для связывания ДНК, гетеродимеры Id с факторами транскрипции bHLH могут не связываться с ДНК. Мы выделили и охарактеризовали клоны гена и кДНК нового белка Id, обозначенного Id2. Белок Id2 содержит мотив спираль-петля-спираль, аналогичный мотиву ранее описанного белка Id (обозначаемого здесь как Id1), но эти два белка отличаются в других местах. Id1 и Id2 кодируются двумя несвязанными генами, как показано на картировании хромосом.Два белка Id обладают сходной ингибирующей активностью. Они избирательно связываются и ингибируют функцию одного набора белков bHLH, типичным примером которого являются E2A.E47 и E2B.m3, но не функции другого набора, включая TFE3, USF и AP4. Белки Id также плохо гомодимеризуются. Экспрессия обоих генов Id подавляется во время дифференцировки в различных типах клеток.

Полный текст

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии. Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (2.0M) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей. Ссылки на PubMed также доступны для Избранные ссылки .

Изображения в этой статье

Щелкните изображение, чтобы увидеть его в увеличенном виде.

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed. Это может быть не полный список ссылок из этой статьи.

• Alessandrini A, Pierce JH, Baltimore D, Desiderio SV. Продолжающаяся перестройка генов иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов в линии лимфоидных клеток-предшественников, трансформированных Ha-ras.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1987, апрель; 84 (7): 1799–1803. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Alonso MC, Cabrera CV. Генный комплекс achaete-scute у Drosophila melanogaster включает четыре гомологичных гена. EMBO J., 1988, август; 7 (8): 2585–2591. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Alt FW, DePinho R, Zimmerman K, Legouy E, Hatton K, Ferrier P, Tesfaye A, Yancopoulos G, Nisen P. Семейство генов myc человека. Колд Спринг Харб Symp Quant Biol. 1986; 51 (Pt 2): 931–941. [PubMed] [Google Scholar]
• Beckmann H, Su LK, Kadesch T.TFE3: белок спираль-петля-спираль, который активирует транскрипцию через мотив muE3 усилителя иммуноглобулина. Genes Dev. 1990 Февраль; 4 (2): 167–179. [PubMed] [Google Scholar]
• Бенезра Р., Дэвис Р.Л., Локшон Д., Тернер Д.Л., Вайнтрауб Х. Идентификатор белка: негативный регулятор белков, связывающих спираль-петля-спираль ДНК. Клетка. 1990, апрель, 6; 61 (1): 49–59. [PubMed] [Google Scholar]
• Блэквелл Т.К., Кретцнер Л., Блэквуд Е.М., Эйзенман Р.Н., Вайнтрауб Х. Связывание ДНК, специфичное для последовательности, белком c-Myc.Наука. 23 ноября 1990 г .; 250 (4984): 1149–1151. [PubMed] [Google Scholar]
• Браун Т., Бушхаузен-Денкер Г., Бобер Э., Танних Э., Арнольд Х. Х. Новый мышечный фактор человека, родственный MyoD1, но отличный от него, вызывает миогенную конверсию в фибробластах 10T1 / 2. EMBO J. 1989 Mar; 8 (3): 701–709. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Braun T, Winter B, Bober E, Arnold HH. Домен активации транскрипции специфичного для мышц ген-регуляторного белка myf5. Природа. 1990 16 августа; 346 (6285): 663–665.[PubMed] [Google Scholar]
• Brennan TJ, Olson EN. Миогенин находится в ядре и приобретает высокое сродство к консервативному энхансерному элементу при гетеродимеризации. Genes Dev. 1990 Апрель; 4 (4): 582–595. [PubMed] [Google Scholar]
• Buchberg AM, Bedigian HG, Taylor BA, Brownell E, Ihle JN, Nagata S, Jenkins NA, Copeland NG. Локализация Evi-2 на хромосоме 11: сцепление с другими локусами протоонкогенов и факторов роста с использованием мышей межвидового обратного скрещивания. Онкоген Res. 1988. 2 (2): 149–165.[PubMed] [Google Scholar]
• Caudy M, Vässin H, Brand M, Tuma R, Jan LY, Jan YN. childless, ген Drosophila, необходимый как для нейрогенеза, так и для определения пола, имеет сходство последовательностей с myc и комплексом achaete-scute. Клетка. 23 декабря 1988 г .; 55 (6): 1061–1067. [PubMed] [Google Scholar]
• Cronmiller C, Schedl P, Cline TW. Молекулярная характеристика бездетного гена, определяющего пол, у дрозофилы с множеством ролей в развитии. Genes Dev. 1988 декабрь; 2 (12A): 1666–1676.[PubMed] [Google Scholar]
• Дэвис Р.Л., Ченг П.Ф., Лассар А.Б., Вайнтрауб Х. Связывающий домен ДНК MyoD содержит код распознавания для активации гена, специфичного для мышц. Клетка. 1990, 9 марта; 60 (5): 733–746. [PubMed] [Google Scholar]
• Дэвис Р.Л., Вайнтрауб Х., Лассар А.Б. Экспрессия одной трансфицированной кДНК превращает фибробласты в миобласты. Клетка. 1987 24 декабря; 51 (6): 987–1000. [PubMed] [Google Scholar]
• Эдмондсон Д.Г., Олсон EN. Ген, гомологичный области сходства myc MyoD1, экспрессируется во время миогенеза и достаточен для активации программы дифференцировки мышц.Genes Dev. 1989 Май; 3 (5): 628–640. [PubMed] [Google Scholar]
• Эллис Х.М., Spann DR, Posakony JW. extramacrochaetae, негативный регулятор развития сенсорных органов у Drosophila, определяет новый класс белков спираль-петля-спираль. Клетка. 1990, 6 апреля; 61 (1): 27–38. [PubMed] [Google Scholar]
• Эфрусси А., Черч Г.М., Тонегава С., Гилберт В. Специфичные для линии B взаимодействия усилителя иммуноглобулина с клеточными факторами in vivo. Наука. 1985, 11 января; 227 (4683): ​​134–140. [PubMed] [Google Scholar]
• Гаррелл Дж., Модолелл Дж.Локус Drosophila extramacrochaetae, антагонист пронейральных генов, который, как и эти гены, кодирует белок спираль-петля-спираль. Клетка. 1990, апрель, 6; 61 (1): 39–48. [PubMed] [Google Scholar]
• Грегор П.Д., Савадого М., Родер Р.Г. Главный фактор поздней транскрипции аденовируса USF является членом группы регуляторных белков спираль-петля-спираль и связывается с ДНК в виде димера. Genes Dev. 1990 Октябрь; 4 (10): 1730–1740. [PubMed] [Google Scholar]
• Henthorn P, McCarrick-Walmsley R, Kadesch T.Последовательность кДНК, кодирующей ITF-2, фактор транскрипции положительного действия. Nucleic Acids Res. 1990, 11 февраля; 18 (3): 678–678. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Hsu HL, Cheng JT, Chen Q, Baer R. Усилитель-связывающая активность онкопротеина tal-1 в сочетании с белками спираль-петля-спираль E47 / E12. Mol Cell Biol. 1991 июн; 11 (6): 3037–3042. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Hu YF, Lüscher B, Admon A, Mermod N, Tjian R. Транскрипционный фактор AP-4 содержит множественные домены димеризации, которые регулируют специфичность димера.Genes Dev. 1990 Октябрь; 4 (10): 1741–1752. [PubMed] [Google Scholar]
• Дженкинс Н.А., Коупленд Н.Г., Тейлор Б.А., Ли Б.К. Организация, распределение и стабильность последовательностей ДНК эндогенного экотропного вируса лейкемии мышей в хромосомах Mus musculus. J Virol. Июль 1982 г., 43 (1): 26–36. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Джастис М.Дж., Силан К.М., Сеси Д.Д., Бухберг А.М., Коупленд Н.Г., Дженкинс Н.А. Карта молекулярно-генетического сцепления хромосомы 13 мыши, закрепленной локусами beige (bg) и satin (sa).Геномика. 1990 Февраль; 6 (2): 341–351. [PubMed] [Google Scholar]
• Kamps MP, Murre C, Sun XH, Baltimore D. Новый ген гомеобокса вносит вклад в ДНК-связывающий домен белка транслокации t (1; 19) в пре-B ALL. Клетка. 1990, 23 февраля; 60 (4): 547–555. [PubMed] [Google Scholar]
• Landschulz WH, Johnson PF, McKnight SL. Лейциновая молния: гипотетическая структура, общая для нового класса ДНК-связывающих белков. Наука. 24 июня 1988 г .; 240 (4860): 1759–1764. [PubMed] [Google Scholar]
• Murre C, McCaw PS, Baltimore D.Новый мотив связывания ДНК и димеризации в связывающих усилителях иммуноглобулинов, бездочерних белках, белках MyoD и myc. Клетка. 1989 10 марта; 56 (5): 777–783. [PubMed] [Google Scholar]
• Мюрре С., Маккоу П.С., Вэссин Х., Кауди М., Ян Л.Й., Ян Ю.Н., Кабрера К.В., Бускин Дж. Н., Хаушка С.Д., Лассар А.Б. и др. Взаимодействия между гетерологичными белками спираль-петля-спираль создают комплексы, которые специфически связываются с общей последовательностью ДНК. Клетка. 1989, 11 августа; 58 (3): 537–544. [PubMed] [Google Scholar]
• Паласиос Р., Карасуяма Х., Ролинк А.Клоны лимфоцитов Ly1 + PRO-B. Фенотип, потребности роста и дифференциация in vitro и in vivo. EMBO J. 1 декабря 1987 г .; 6 (12): 3687–3693. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Patel VP, Lodish HF. Матрица фибронектина необходима для дифференцировки мышиных эритролейкозных клеток в ретикулоциты. J Cell Biol. 1987 декабрь; 105 (6 Pt 2): 3105–3118. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rhodes SJ, Konieczny SF. Идентификация MRF4: нового члена семейства генов фактора регуляции мышц.Genes Dev. 1989 декабрь; 3 (12B): 2050–2061. [PubMed] [Google Scholar]
• Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С., Шарф С.Дж., Хигучи Р., Хорн Г.Т., Маллис К.Б., Эрлих Г.А. Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. Наука. 29 января 1988 г .; 239 (4839): 487–491. [PubMed] [Google Scholar]
• Сэнгер Ф., Никлен С., Колсон А.Р. Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1977 Dec; 74 (12): 5463–5467. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Siracusa LD, Jenkins NA, Copeland NG.Идентификация и применение повторяющихся зондов для картирования генов у мышей. Генетика. 1991, январь; 127 (1): 169–179. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Smith DB, Johnson KS. Одностадийная очистка полипептидов, экспрессируемых в Escherichia coli в виде слияния с глутатион-S-трансферазой. Ген. 15 июля 1988 г .; 67 (1): 31–40. [PubMed] [Google Scholar]
• Стрикленд С., Махдави В. Индукция дифференцировки в стволовых клетках тератокарциномы ретиноевой кислотой. Клетка. 1978 Октябрь; 15 (2): 393–403.[PubMed] [Google Scholar]
• Sun XH, Baltimore D. Ингибирующий домен фактора транскрипции E12 предотвращает связывание ДНК в гомодимерах E12, но не в гетеродимерах E12. Клетка. 1991 25 января; 64 (2): 459–470. [PubMed] [Google Scholar]
• Villares R, Cabrera CV. Генный комплекс achaete-scute D. melanogaster: консервативные домены в подмножестве генов, необходимых для нейрогенеза, и их гомология с myc. Клетка. 31 июля 1987 г .; 50 (3): 415–424. [PubMed] [Google Scholar]
• Воронова А., Балтимор Д.Мутации, которые нарушают связывание ДНК и образование димеров в белке спираль-петля-спираль E47, картируются в отдельные домены. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1990 июн; 87 (12): 4722–4726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wright WE, Sassoon DA, Lin VK. Миогенин, фактор, регулирующий миогенез, имеет домен, гомологичный MyoD. Клетка. 1989 24 февраля; 56 (4): 607–617. [PubMed] [Google Scholar]

Статьи из молекулярной и клеточной биологии любезно предоставлены Американским обществом микробиологов (ASM)

ID2 — обзор | ScienceDirect Topics

4 Механизмы спецификации дендритных клеток

Пре-кДК, определяемый как Lin ^— CD135 ⁺ CD11c ⁺ MHCII ^— CD172 ^— CX3CR1-GFP ^{+, первоначально сообщалось от до + дают начало cDC1 и cDC2, но не pDC у мышей, и аналогичная популяция была описана у людей (Breton, Lee, Liu, & Nussenzweig, 2015; Breton et al., 2015, 2016; Лю и др., 2009). Однако теперь понятно, что в этой популяции существует значительная неоднородность. Исследования, выявившие эту гетерогенность, позволили выделить клоногенные предшественники кДК на основе экспрессии CD115, CD117, SiglecH, Ly6C, Zbtb46 и CCR9 (Breton et al., 2016; Grajales-Reyes et al., 2015; Schlitzer et al. ., 2011, 2015; См. И др., 2017; Виллани и др., 2017).}

Механистическим объяснением исключения потенциала pDC является индукция ID2 для ингибирования E2-2, который необходим для развития pDC (Reizis, Bunin, Ghosh, Lewis, & Sisirak, 2011).Е-белки, включая E2-2 / Tcf4 , E2A / Tcf3 и HEB / Tcf12 , являются факторами транскрипции, содержащими основной домен спираль-петля-спираль (HLH), которые активируют транскрипцию при гетеродимеризации с другими факторами транскрипции HLH, такие как MyoD (Lassar et al., 1989; Murre et al., 1989; Wang & Baker, 2015). Белки ID представляют собой белки, содержащие домен HLH, у которых отсутствует основной ДНК-связывающий домен. Следовательно, белки ID могут гетеродимеризоваться с белками bHLH для ингибирования транскрипции, опосредованной Е-белком (Benezra, Davis, Lockshon, Turner, & Weintraub, 1990).Независимые исследования показали, что Id2 и Tcf4 необходимы для развития cDC1s и pDCs, соответственно (Cisse et al., 2008; Hacker et al., 2003). Последующая идентификация пре-кДК как предшественника с бипотенциалом для субнаборов сДК1 и сДК2 привела к гипотезе о том, что репрессия E2.2 с помощью ID2 необходима для спецификации кДК (Geissmann et al., 2010; Liu et al., 2009) . Однако доказательства того, что cDC2s развиваются нормально у мышей Id2 ^{— / —} , несовместимы с этой моделью, поскольку для развития cDC2 также требуется зависимость от Id2 .

Tcf4 выражается всеми подмножествами DC, но наиболее сильно выражается в pDC. Более точный анализ экспрессии изоформы Tcf4 с помощью RNA-Seq выявил две изоформы, причем длинная изоформа экспрессируется исключительно с помощью pDC (Grajkowska et al., 2017). ATAC-Seq pDC и cDC показал, что хроматин вокруг промотора Tcf4 доступен во всех субпопуляциях DC и что специфичность экспрессии Tcf4 контролируется 3′-энхансером, доступным только в pDC.Делеции длинной изоформы Tcf4 было недостаточно для подавления развития pDC. Однако было высказано предположение, что ранняя экспрессия длинной изоформы в CDP может быть событием, которое приводит к более высокой экспрессии TCF4 и приверженности к линии pDC (Grajkowska et al., 2017; Reizis, 2019).

Растущие данные подтверждают модель эпистаза между ZEB2 и ID2, которая контролирует спецификацию предшественников костного мозга для подмножеств pDC и cDC1 соответственно (Bagadia, Huang, Liu, & Murphy, 2019).Две независимые группы сообщили, что фактор транскрипции, ZEB2, также необходим для развития pDC (Scott et al., 2018; Wu et al., 2016). Хотя механизм, с помощью которого ZEB2 регулирует развитие DC, остается активной областью исследований, оба исследования предоставили предварительные доказательства эпистаза с ID2. Они оба сообщили, что DC2, дефицитные по Zeb2 in vivo, имеют увеличение экспрессии Id2 . Анализ мотива in silico промотора Id2 идентифицировал предполагаемый сайт связывания ZEB2 с помощью ChIP-qPCR.Таким образом, было высказано предположение, что ZEB2 действует, чтобы напрямую ингибировать транскрипцию Id2 (Scott et al., 2018; Wu, Briseno, Grajales-Reyes, et al., 2016). Однако высокопроизводительный ChIP-Seq не проводился, и антитело ZEB2 не является общедоступным. Следовательно, потребность в ZEB2 в прямой репрессии транскрипции Id2 еще предстоит установить.

Отдельная популяция pre-cDC1 была недавно идентифицирована по экспрессии Zbtb46 в CDP.Результаты показали, что спецификация pre-cDC1 происходит раньше, чем приобретение CD11c и MHCII, и до потери экспрессии CD115 (Bagadia, Huang, Liu, Durai, et al., 2019). По сравнению с CDP, этот более ранний предшественник экспрессировал более высокие уровни факторов транскрипции, которые регулируют развитие cDC1, включая Nfil3 и Batf3 . Точно так же репрессия Zeb2 совпала с индукцией Id2 . В соответствии с этими результатами, индукция Zbtb46 в качестве маркера спецификации не встречалась в Nfil3 ^{— / —} .Потеря cDC1 у Nfil3 ^{— / —} мышей была спасена у Zeb2 ^{— / —} Nfil3 ^{— / —} мышей, демонстрируя, что Nfil3 находится выше по течению по сравнению с Zeb2 в разработке. , возможно, как репрессор экспрессии Zeb2 . Точно так же потеря cDC1 у Id2 ^{— / —} мышей может быть спасена у Id2 ^{— / —} Zeb2 ^{— / —} мышей, демонстрируя, что Zeb2 действует ниже Id2 по отношению к к развитию cDC1, возможно, как непрямой репрессор экспрессии Zeb2 .Однако Id2 был выражен на нормальных уровнях в Zeb2 ^{— / —} Nfil3 ^{— / —} , несмотря на требование Nfil3 для спецификации cDC1. Это предполагает, что Zeb2 действует выше Id2 , возможно, репрессируя экспрессию Id2 . Это д. Установить взаимно репрессивный эпистаз между Zeb2 и Id2 , что может быть основанием для исключения судьбы pDC. Экспрессия Zeb2 не маркирует pDC-специфические предшественники в CDP и не требуется для развития cDC2.Следовательно, взаимное подавление Zeb2 и Id2 недостаточно, чтобы исключить только спецификацию cDC2. Вместе эти данные предполагают, что pDCs и cDC1 имеют общего предшественника, который отличается от CDP до спецификации cDC2 (Bagadia, Huang, Liu, & Murphy, 2019).

Поддержание экспрессии Irf8 необходимо для спецификации cDC1 и выживания в периферических тканях (Aliberti et al., 2003; Schiavoni et al., 2004, 2002). Также считалось, что развитие pDC зависит от Irf8 (Schiavoni et al., 2002). Однако недавно было показано, что pDCs развиваются у Irf8 ^{— / —} мышей, но имеют измененный поверхностный фенотип (Sichien et al., 2016). Irf8 , однако, требовался для функции pDC. Было замечено, что Irf8 ^{— / —} пДК индуцировали экспрессию Irf4 , и сообщалось, что развитие пДК может быть отменено в Irf8 ^{— / —} Irf4 ^{— / —} . Следовательно, Irf4 может спасти развитие pDC и компенсировать потерю Irf8 .Однако у мышей Irf8 ^{— / —} Irf4 ^{— / —} отсутствует развитие всех линий DC, поэтому механизм, с помощью которого Irf4 является достаточным для компенсации Irf8 , остается неясным (Tamura et al., 2005).

Дифференциальные функции убиквитинирования FANCI и FANCD2 стабилизируют комплекс ID2 на ДНК

Введение

Восстановление повреждений ДНК является важным аспектом клеточной биологии, и для борьбы с различными типами повреждений ДНК были разработаны многочисленные пути [1].Анемия Фанкони (FA) — редкое генетическое заболевание, которое возникает из-за мутаций в любом из генов группы комплементации анемии Fanconi ( FANC ), продукты которой участвуют в репарации межстандартных перекрестных связей ДНК (ICL) [2,3] а также в поддержании стабильности генома в ответ на стресс репликации [4,5]. Несмотря на то, что гены пути FA довольно редко встречаются в общей популяции, у онкологических больных часто изменяются [3].

Ключевым этапом на этом пути является убиквитинирование пары паралогичных белков, FANCI (~ 150 кДа) и FANCD2 (~ 160 кДа) [6,7], что способствует их удержанию на хроматине [7,8].В частности, было показано, что убиквитинирование FANCD2 необходимо для устойчивости клеток к митомицину C [6,9], который способствует развитию ICL. В отличие от типичных событий убиквитинирования, FANCI и FANCD2 специфически моноубиквитинируются по одному консервативному лизину. Ube2T-FANCL — пара E2-E3, которая опосредует убиквитинирование [10,11]. У многих эукариот, включая человека, FANCL включен в псевдодимерный комплекс ~ 1 MDa, известный как ядерный комплекс FA [12-14]. Удаление убиквитинов на FANCI и FANCD2 также является критическим для пути FA, и эта стадия деубиквитинирования катализируется комплексом USP1-UAF1 [15,16].

Данные свидетельствуют о том, что FANCI и FANCD2 участвуют в рекрутировании других белков [8,17]. Однако механистические и структурные детали роли убиквитинирования остаются неоднозначными. Было показано, что два белка связывают in vivo с [7] и образуют гетеродимер in vitro [18]. Кристаллическая структура неубиквитинированного комплекса FANCI-FANCD2 (ID2) мыши показала, что каждый паралог имеет обширную α-соленоидную складку, скрученную в саксофоноподобную форму [18].Интересно, что лизины-мишени для убиквитинирования частично скрыты на границе раздела FANCI-FANCD2, который простирается через N-концевую половину белков. Было высказано предположение, что убиквитин, конъюгированный на FANCI, взаимодействует с FANCD2 [19]. Присутствие ДНК способствует убиквитинированию как изолированного FANCI, так и комплекса ID2 in vitro [20,21], но в настоящее время неизвестно, как это достигается. В то время как изолированный комплекс FANCI и ID2, как хорошо известно, связывается с различными структурами ДНК [18,20-23], изолированный FANCD2 менее хорошо установлен для связывания ДНК [18,22,24].Мутация пациента FA в FANCI, R1285Q, которая снижает убиквитинирование комплекса ID2 [20,21], как предполагается, снижает связывание ДНК FANCI и ID2, а также взаимодействие FANCI с FANCD2; однако величина снижения связывания ДНК различается между исследованиями [20-22].

Хотя моноубиквитинирование FANCD2 документировано в течение почти двух десятилетий [6], а моноубиквитинирование FANCI — более одного десятилетия [7], молекулярная функция этих модификаций остается неуловимой.Это во многом связано с трудностями выделения чистых моноубиквитинированных белков FANCI и FANCD2 для исследований in vitro . Недавние достижения в понимании аллостерической активации Ube2T с помощью FANCL позволили разработать сконструированный Ube2T, который сохраняет специфичность лизина FANCI / FANCD2, но демонстрирует повышенную активность моноубиквитинирования [25]. Этот сконструированный Ube2T облегчил получение и выделение высокоочищенных убиквитинированных FANCI и FANCD2 [26].Здесь мы использовали этот подход для восстановления человеческого комплекса ID2 в различных состояниях убиквитинирования и охарактеризовали связывание ДНК для каждого состояния. Мы показываем, что убиквитинирование FANCD2 значительно усиливает связывание комплекса ID2 с дцДНК, тогда как убиквитинирование FANCI, по-видимому, не требуется для этой цели. КриоЭМ-карты убиквитинированного FANCD2 в комплексе либо с FANCI, либо с убиквитинированным FANCI и дцДНК демонстрируют закрытие комплекса ID2 посредством образования нового интерфейса белок-белок на С-концах.Этот интерфейс явно нарушен у патогенного мутанта FANCI R1285Q. Мы также демонстрируем, что убиквитинирование FANCI в значительной степени защищает комплекс ID2 от деубиквитинирования USP1-UAF1, что, вероятно, способствует поддержанию связанного с убиквитинизацией усиления связывания ID2-ДНК в клеточном контексте. Следовательно, кажется, что убиквитинирование FANCI и FANCD2 имеют разные функции, но сходятся для облегчения и поддержания улучшенного связывания ID2-ДНК.

Результаты

Убиквитинирование FANCD2 усиливает связывание ID2-дцДНК

Чтобы выяснить, влияет ли убиквитинирование FANCI и FANCD2 на связывание ID2-ДНК, мы сначала очистили убиквитинированный FANCI (I _Ub ) и убиквитинированный FANCI _{6 (DANCD} ). используя наш ранее установленный протокол [26].Затем мы воссоздали неубиквитинированный комплекс (ID2), комплекс с убиквитином только на FANCD2 (ID2 _Ub ) и комплекс с убиквитином как на FANCI, так и на FANCD2 (IUbD2Ub). Мы использовали как анализы сдвига электроподвижности на основе геля (EMSA; ~ 4 ° C), так и методы увеличения флуоресценции, индуцированной белком (PIFE; 22 ° C) [27], чтобы определить очевидную аффинность связывания дцДНК (32 пары оснований, маркировка IRDye700; Фигура 1). Оба метода, хотя и привели к разным измеренным аффинностям, показали поразительное усиление связывания ДНК после убиквитинирования FANCD2, которое варьировалось от 7-кратного (EMSA; рис. 1A) до 10-кратного (PIFE; рис. 1B).Связывание ДНК не было обнаружено при аналогичных концентрациях для изолированного D2Ub, что позволяет предположить, что убиквитин на FANCD2 не требуется для связывания ДНК per se, , но обеспечивает более сильное взаимодействие ID2-ДНК. Интересно, что димонубиквитинированный комплекс (IUbD2Ub) не приводил к заметному изменению связывания дцДНК по сравнению с ID2 _Ub . Эти данные свидетельствуют о том, что убиквитинирование FANCD2 служит либо для стимулирования, либо для стабилизации связывания ID2-ДНК.

ДцДНК, меченная IRDye700 длиной 32 нуклеотида, была использована для оценки связывания ID2-дцДНК, когда ни один белок не убиквитинирован (I + D2), когда убиквитинирован только FANCD2 (I + D2 _Ub ) и когда и FANCD2, и FANCI. убиквитинированы (I _Ub + D2 _Ub ).

A. Top : Инфракрасный сигнал свободной и связанной с белком ДНК, когда дцДНК (при 2 нМ) инкубировали с возрастающими количествами (4, 16, 32, 64, 128, 256 и 512 нМ конечные) не / single / double-ubiquitinated белковые комплексы His ₆ -TEV-V5-FANCI и Flag-FANCD2 (I + D2, I _Ub + D2 _Ub , I + D2 _Ub ), впоследствии смеси были запущены на неденатурирующие гели.Убиквитинированный FLAG-FANCD2 в указанных выше концентрациях также оценивали на связывание дцДНК, чтобы проверить, имеет ли FANCD2 какое-либо возможное внутреннее сродство связывания с ДНК после убиквитинирования. Внизу слева : процентное соотношение ДНК, связанной с белком, к общему сигналу ДНК для каждой концентрации комплекса ID2 (среднее значение ± стандартное отклонение) нанесено на график в зависимости от различных концентраций ID2, а также для D2 _Ub отдельно. Модель связывания с одним сайтом была приспособлена для построения кривых связывания для каждого из различных состояний убиквитинирования ID2. Внизу справа : гистограмма, показывающая средние кажущиеся значения Kd, рассчитанные на основе модели связывания с одним сайтом. Планки погрешностей: 95% доверительные интервалы; n: количество повторов.

B. Слева : изменения флуоресценции дцДНК, меченной IRDye700 (при 125 нМ), при инкубации при увеличивающихся концентрациях ID2 (I + D2, I _Ub + D2 _Ub , I + D2 _Ub и D2 _Ub ) в диапазоне от 1,3 нМ до 5,9 мкМ. Измерение усиления флуоресценции для каждого комплекса ID2 проводили для двух отдельно приготовленных комплексов, и все точки данных для каждой комбинации белков использовали для подгонки к модели связывания с одним сайтом. Справа : гистограмма, показывающая средние кажущиеся значения Kd, рассчитанные по квадратным уравнениям одноузловой ассоциации. Планки погрешностей: 95% доверительные интервалы.

Убиквитинирование FANCD2 связано с образованием вторичного интерфейса ID2

Для изучения структурных деталей повышенной аффинности связывания ДНК мы определили криоЭМ-карты восстановленных комплексов ID2 с убиквитинированным FANCD2 при умеренном разрешении (рис. 2A, EV1). Безреференсные средние значения 2D-класса для ID2 _Ub и I _Ub D2 _Ub -dsDNA имели сходные общие формы, но отличались от предыдущих неубиквитинированных средних значений класса ID2 [12], что намекало на грубые конформационные изменения при убиквитинировании FANCD2.Реконструированные карты ID2 _Ub и I _Ub D2 _Ub -dsDNA с разрешением 25 и 12 Å, соответственно, обе имели замкнутую торообразную форму. Подгонка усеченной кристаллической структуры ID2 мыши в карту I _Ub D2 _Ub -dsDNA привела к плохой подгонке (Рисунок 2B; левая панель ), но гибкая подгонка с использованием iMODFIT [28] с ограничениями вторичной структуры улучшила согласие (оценка взаимной корреляции от 0,56 до 0,85). Первичное движение произошло для C-терминальной «руки» FANCD2 и привело к образованию нового интерфейса с C-терминальной «рукой» FANCI, которая закрывает комплекс ID2 (рис. 2B; правая панель ).В дальнейшем мы будем называть этот интерфейс интерфейсом Arm ID2. Карта различий между подобранной моделью и экспериментальной картой иллюстрирует трубчатый объем, наиболее вероятно представляющий связанную ДНК. Этот объем расположен сразу под интерфейсом Arm ID2 и заключен внутри тора (Рисунок 2B; правая панель ), предполагая, что формирование интерфейса Arm ID2 необходимо для этой привязки конформации. При этих разрешениях мы не можем однозначно разместить конъюгированные убиквитины.Мы предполагаем, что закрытая конформация должна быть стабилизирована, чтобы прочно связывать ДНК, и для этой цели действует убиквитинирование FANCD2.

Top : выбранные микрофотографии с вручную отобранными частицами, обозначенными зелеными кружками. Внизу : Кривые корреляции Фурье-оболочки (FCS) для каждого набора данных. Для набора данных IUbD2Ub-dsDNA маскирование выполнялось с фазовой рандомизацией до 23 Å, и указанные разрешения относятся к скорректированной кривой FSC.

A. Слева : КриоЭМ 2D-классы молекул ID2 _Ub и I _Ub D2 _Ub -dsDNA. Справа : Результирующие 3D-реконструкции ID2 _Ub и I _Ub D2 _Ub -ДНК. Обе структуры имеют форму тора.

B. Слева : твердое тело атомной структуры ID2 мыши (3S4W) соответствует криоЭМ-карте IUbD2Ub-dsDNA человека. Справа : Гибкая подгонка атомной модели ID2 мыши к криоЭМ-карте человеческого I _Ub D2 _Ub -dsDNA (iMODFIT). «Руки» C-конца FANCD2 и FANCI закрываются в гибком фитинге. Трубчатый объем криоЭМ IUbD2Ub-ДНК, сразу под интерфейсом Arm ID2 (плотная плотность), который не занят структурой ID2 iMODFIT, вероятно, представляет собой связанную ДНК.

Интерфейс Arm ID2 необходим для эффективного убиквитинирования ID2

Интересно, что сайт патогенной мутации FANCI R1285Q находится рядом с интерфейсом Arm ID2 (рис. 3A).Поэтому мы предположили, что эта мутация может нарушать убиквитинирование ID2, предотвращая образование закрытого состояния ID2. Сначала мы исследовали, вызывает ли эта мутация какие-либо изменения в способности FANCI взаимодействовать с ДНК и FANCD2, а также влияет ли она на его способность к убиквитинизации. Мы обнаружили, что белки как дикого типа (I ^WT ), так и мутантные (I ^R1285Q ) могут быть убиквитинированы in vitro в одинаковой степени, а добавление ДНК привело к сопоставимому усилению убиквитинирования между двумя белками (рис. 3Б).Кроме того, измеряя аффинности связывания RED-трис-NTA (Nanotemper), меченного His-tag I ^WT и I ^R1285Q для FANCD2 (с использованием PIFE), мы обнаружили, что аффинности были одинаковыми, и оба в низком наномолярном диапазоне. (Рисунок 3C). Тем не менее, мутация FANCI привела к очевидному снижению убиквитинирования ID2 (рис. 3D), что согласуется с предыдущими результатами [20,21].

A. Аргинин 1285 из FANCI, который мутирован у некоторых пациентов с FA, расположен в интерфейсе Arm ID2 в нашей структуре cryoEM I _Ub D2 _Ub -dsDNA.

B. Как FANCI дикого типа (I ^WT ), так и мутант R1285Q (I ^R1285Q ) можно эффективно убиквитинировать в присутствии ДНК. Реакции проводили с 2 мкМ субстрата FANCI в течение 60 мин в отсутствие или в присутствии 4 мкМ оцДНК.

C. Как FANCI дикого типа (I ^WT ), так и мутант R1285Q (I ^R1285Q ) эффективно связываются с FANCD2.Изменения флуоресценции, возникающие при нанесении на график RED-трис-NTA-меченного FANCI (I ^WT или I ^R1285Q ; оба при 60 нМ) инкубировали при возрастающих концентрациях FANCD2 (в диапазоне от 2,48 нМ до 5,08 мкМ) (средние значения два повтора с показанными полосами ошибок стандартного отклонения) для каждой концентрации FANCD2 и кажущиеся значения Kd (среднее ± SEM) были определены путем подгонки к модели связывания с одним сайтом.

D. FANCD2 в составе комплекса I ^R1285Q D2 устойчив к убиквитинированию.Реакции проводили при 4 мкМ субстрата ID2 и 16 мкМ дцДНК. Прогресс убиквитинирования FANCD2 и FANCI контролировали вестерн-блоттингом после SDS-PAGE.

E. Убиквитинирование FANCD2 может усиливать связывание ID2-ДНК только тогда, когда D2 _Ub образует комплекс с I ^WT , но не в комплексе с I ^R1285Q , как определено с помощью EMSA. Top : Инфракрасный сигнал свободной и связанной с белком ДНК при инкубации дцДНК, меченной IRDye700 (при 2 нМ) с возрастающими количествами (4, 16, 32, 64, 128, 256 и 512 нМ в конечном итоге) His ₆ -FANCI и FLAG-FANCD2, а затем смеси обрабатывали на неденатурирующих гелях. Внизу слева : процентное соотношение ДНК, связанной с белком, к общему сигналу ДНК для каждой концентрации комплекса ID2 (средние значения из двух повторов с показанными столбцами ошибок стандартного отклонения) нанесены на график в зависимости от различных используемых концентраций ID2. Модель связывания с одним сайтом была приспособлена для построения кривых связывания для каждого из различных состояний убиквитинирования ID2. Внизу справа : гистограмма, показывающая средние кажущиеся значения Kd, рассчитанные на основе модели связывания с одним сайтом. Планки погрешностей: 95% доверительные интервалы.

F. Убиквитинирование FANCD2 может усиливать связывание ID2-ДНК только тогда, когда D2 _Ub образует комплекс с I ^WT , но не в комплексе с I ^R1285Q , как определено PIFE. Слева : флуоресценция изменяется при инкубации дцДНК, меченной IRD700 (при 125 нМ), при увеличивающихся концентрациях I ^R1285Q + D2 или I ^R1285Q + D2 _Ub (комплексные концентрации в диапазоне от 1,54 нМ до 3,8 мкМ). Измерение усиления флуоресценции для каждой комбинации белков проводили для двух отдельно приготовленных комплексов, и все точки данных для каждой комбинации белков использовали для подгонки к модели связывания с одним сайтом. Справа : гистограмма, показывающая средние кажущиеся значения Kd, рассчитанные на основе модели связывания с одним сайтом. Планки погрешностей: 95% доверительные интервалы. Расчетные кривые I ^WT + D2 и I ^WT + D2 _Ub и соответствующие значения диапазона Kd (рисунок 1B) также показаны для сравнения.

Интересно, что реконструированный мутантный комплекс I ^R1285Q D2 _Ub вел себя иначе в отношении связывания дцДНК по сравнению с комплексом ID2 _Ub дикого типа.EMSA выявило лишь незначительное снижение аффинности ID2-ДНК, когда FANCI был мутирован в FANCI ^R1285Q , а когда FANCD2 был убиквитинирован, аффинность ID2-ДНК существенно не увеличилась, в отличие от комплекса дикого типа (рис. 3E). PIFE аналогичным образом показал небольшое увеличение аффинности I ^R1285Q D2-ДНК, когда FANCD2 был убиквитинирован (фигура 3F), в отличие от уровней, наблюдаемых для I ^WT D2 по сравнению с I ^WT D2 _Ub . Взятые вместе, эти результаты предполагают, что мутация пациента FANCI ^R1285Q не изменяет напрямую связывание ID2-дцДНК, а вместо этого ограничивает убиквитинирование ID2 и связанное с ним усиление связывания ДНК.Вероятно, это достигается за счет нарушения интерфейса Arm ID2, наблюдаемого в закрытом состоянии ID2. Следовательно, потеря комплексного убиквитинирования I ^R1285Q D2 может быть объяснена, если закрытое состояние важно для убиквитинирования.

Убиквитинирование FANCI защищает комплекс ID2

Комплекс USP1-UAF1 специфически нацелен на убиквитинированный FANCD2 для деубиквитинирования с использованием N-концевого модуля USP1 [29]. Хотя это может происходить, когда D2 _Ub изолирован или находится в комплексе с FANCI, димоноубиквитинированные комплексы ID2 (I _Ub D2 _Ub ), связанные с ДНК, остаются в значительной степени устойчивыми к деубиквитинированию USP1-UAF1 [29,30].Таким образом, мы предположили, что, поскольку убиквитинирование FANCI не участвует напрямую в усилении связывания ID2-ДНК, его роль может заключаться в защите убиквитина FANCD2 от активности USP1-UAF1. Чтобы изучить, в какой степени присутствие I или I _Ub влияет на деубиквитинирование D2 _Ub , мы сравнили процесс деубиквитинирования D2 _Ub , ID2 _Ub и I _Ub D2 _Ub с помощью USP1-UAF1 ( в присутствии дцДНК) в реальном времени (рис. 4А). USP1-UAF1 при низких (25 нМ) концентрациях деубиквитинировал как D2 _Ub , так и ID2 _Ub с одинаковой скоростью.Однако субстрат I _Ub D2 _Ub оставался почти полностью устойчивым к активности USP1-UAF1 (рис. 4A; слева, ). При более высоких концентрациях USP1-UAF1 (100 нМ) мы обнаружили, что FANCD2 может деубиквитинироваться, хотя и медленнее, чем D2 _Ub и ID2 _Ub , которые быстро деубиквитинируются менее чем за 10 минут (рис. 4A; справа ). ). Эти данные предполагают, что доступ к убиквитину на FANCD2 для USP1-UAF1 снижается, когда он находится в комплексе с убиквитинированным FANCI и ДНК.

A. USP1-UAF1 может эффективно деубиквитинировать D2 _Ub в присутствии или в отсутствие FANCI (I), но не в присутствии убиквитинированного FANCI (IUb). Убиквитинированный His ₆ -3C-FANCD2 (D2Ub) смешивали с дцДНК длиной 50 нуклеотидов и либо с His ₆ -TEV-V5-FANCI (I), убиквитинированным His ₆ -TEV-V5-FANCI ( IUb) или без белка; смеси белок-ДНК затем инкубировали с USP1-UAF1 (при 25 нМ или 100 нМ) в течение указанных периодов времени.Деубиквитинирование Ub D2 _{и Ub} I _{оценивали после SDS-PAGE окрашиванием гелей Кумасси, а также вестерн-блоттингом перенесенных блотов со специфическим антителом FANCD2.}

B. USP7 и USP2 могут деубиквитинировать D2 _Ub изолированно, но их активность по отношению к D2 _Ub значительно снижается в присутствии FANCI (I) или убиквитинированного FANCI (IUb). Реакции проводили как в А, но с 100 нМ USP7 или USP2. Деубиквитинирование оценивали после SDS-PAGE окрашиванием Кумасси.

C. Расположение в структуре убиквитина (PDB: 1ubq) четырех гидрофобных остатков, выбранных для мутации в аланин. Вверху : расположение F4, I36, I44 и L73 (показано красным) на поверхности убиквитина (показано желтым). Нижняя часть : то же, что и выше, но поверхность убиквитина окрашена в соответствии с зарядом (красный: отрицательный, синий: положительный, белый: нет заряда).

D. Динамика убиквитинирования FANCI с различными мутантами убиквитина и соответствующая чувствительность / устойчивость к опосредованному USP1-UAF1 деубиквитинированию полученных продуктов.Реакции деубиквитинирования в присутствии или в отсутствие USP1-UAF1 (100 нМ) происходили в течение 30 минут.

E. Динамика деубиквитинирования, опосредованного USP1-UAF1 I _Ub D2 _Ub -ДНК-комплексы, состоящие из D2 _Ub , дцДНК длиной 50 нуклеотидов и I _Ub , продуцируемых различными мутантами убиквитина или убиквитин дикого типа (WT). Прогресс реакции деубиквитинирования оценивали после SDS-PAGE как по окрашиванию гелей Кумасси, так и по вестерн-блоттингу перенесенных блотов со специфическим антителом FANCD2.Убиквитинирование FANCI указанными мутантами убиквитина (или WT) и последующее деубиквитинирование полученных комплексов ДНК I _Ub D2 _Ub проводили дважды; остаточное убиквитинирование FANCD2, рассчитанное из блотов FANCD2 для каждой временной точки, наносили на график для каждого типа убиквитина в белковом комплексе (среднее значение ± стандартное отклонение). Статистически значимые изменения по сравнению с убиквитином дикого типа (тест ANOVA с повторными измерениями с поправкой Бонферрони) отмечены звездочками (красный: F4A; фиолетовый: I44A).* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Поскольку USP1-UAF1 является специфической деубиквитиназой для FANCD2 [15,29], мы хотели оценить, могут ли альтернативные DUB, которые не имеют специфичности FANCD2 (т. Е. Нацелены на структурно разнообразные субстраты), также получить доступ к убиквитину на FANCD2, когда это возможно. в комплексе с I или IUb. Мы также проанализировали деубиквитинирование D2Ub, ID2 _Ub и IUbD2 _Ub с помощью USP7 и USP2 (в присутствии дцДНК) во времени (рис. 4В). В то время как USP7 и USP2 могли деубиквитинировать D2 _Ub изолированно, присутствие FANCI или убиквитинированного FANCI снижало деубиквитинирование D2 _Ub .Это предполагает, что в комплексах ДНК ID2 _Ub и I _Ub D2 _Ub -ДНК убиквитин на FANCD2 защищен от общей активности DUB. Однако только присутствие убиквитинированного FANCI может защитить убиквитин на FANCD2 от деубиквитинирования USP1-UAF1.

Одно из объяснений того, что убиквитин FANCI необходим для формирования резистентного комплекса DUB a, состоит в том, что конъюгированный убиквитин FANCI взаимодействует с FANCD2. Убиквитин обычно взаимодействует с другими белками через любой из своих трех (F4, I36 и I44) гидрофобных участков [31].Таким образом, мы мутировали четыре ключевых гидрофобных остатка убиквитина, расположенные внутри этих участков, которые находятся в разных областях структуры убиквитина (рис. 4С). Впоследствии мы убиквитинировали FANCI (в присутствии дцДНК) с использованием либо дикого типа, либо любого из этих четырех мутантов убиквитина (F4A, I36A, L73A или I44A). Почти полное убиквитинирование FANCI было достигнуто для каждого мутанта и убиквитина дикого типа (рис. 4D). Мы тестировали каждый I _Ub в анализах DUB и обнаружили, что только I _Ub-I44A также деубиквитинировался в той же степени, что и I _Ub-WT под действием USP1-UAF1.Мутация I36A привела к частичной потере, тогда как мутации F4A и L73A убиквитина привели к полной потере активности USP1-UAF1 (рис. 4D). Чтобы собрать комплекс ДНК I _Ub D2 _Ub с мутантами убиквитина на FANCI, мы добавили D2 _Ub к каждому убиквитин-мутированному I _Ub и подвергли полученный комплекс ДНК I _Ub D2 _Ub -ДНК лечение деубиквитинизацией USP1-UAF1 (рис. 4E). Обе мутации убиквитина F4A и I44A, несмотря на их противоположные эффекты на деубиквитинирование только FANCI, привели к повышенной чувствительности к деубиквитинированию FANCD2.Мутации I36A и L73A оказали незначительное влияние на деубиквитинирование FANCD (рис. 4E). Такой же эффект I44A и F4A на деубиквитинирование FANCD2 наблюдался при использовании в четыре раза более низких концентраций USP1-UAF1 в анализах DUB с одной временной точкой (рисунок EV2A). Мы предположили, что эти мутации не повлияли на связывание ID2-ДНК или образование комплексов, поскольку комплексы WT, F4A и I44A I _Ub D2 _Ub по-прежнему способны эффективно связывать ДНК, в отличие от одного I _Ub (рисунок EV2B) или D2 _{Только Ub} (Рисунок 1).Взятые вместе, гидрофобные поверхности F4 и I44 на убиквитине важны для опосредованной I _Ub защиты D2 _Ub , возможно, посредством взаимодействия с FANCD2.

A. FANCI был сначала убиквитинирован in vitro в присутствии избытка дцДНК с использованием убиквитина дикого типа (WT) или указанных мутантов убиквитина.Затем убиквитинированные продукты FANCI смешивали с убиквитинированным FANCD2, и полученные комплексы IUbD2Ub-ДНК инкубировали с USP1-UAF1 (25 нМ) в течение 30 минут. Деубиквитинирование FANCD2 и FANCI через 0 и 30 минут контролировали вестерн-блоттингом. % Деубиквитинирования FANCD2 за этот период, рассчитанный из блоттингов FANCD2, полученных из трех повторных экспериментов с DUB, был нанесен на график для каждого типа убиквитина (среднее значение ± стандартное отклонение). Статистически значимые изменения по сравнению с убиквитином дикого типа (односторонний тест ANOVA с поправкой Бонферрони) отмечены звездочками.*** р <0,001.

B. I _Ub D2 _Ub Комплексы с мутантами убиквитина F4A или I44A на FANCI могут эффективно связываться с дцДНК. Кривые связывания ДНК PIFE для комплексов I _Ub D2 _Ub , состоящих из D2 _Ub и I _Ub , продуцированных либо с убиквитином дикого типа (WT), либо с указанными мутантами убиквитина. Меченую IRD700 дцДНК (при 125 нМ) инкубировали при возрастающих концентрациях соответствующих комплексов IUbD2 _Ub или контроля I _Ub (в диапазоне от 5.86 нМ до 1,5 мкМ), и зарегистрированные изменения флуоресценции были нанесены на график для каждой концентрации белка вместе с соответствием модели связывания с одним сайтом.

Интересно, что убиквитин на FANCI также был защищен от деубиквитинирования USP2, USP7 и USP1-UAF1 в комплексе I _Ub D2 _Ub -ДНК. Фактически, в контексте комплекса IUbD2Ub-ДНК деубиквитинирование FANCI с помощью USP1-UAF1 было даже медленнее, чем деубиквитинирование FANCD2, и было неполным на 40 минут (рисунок EV3). Однако изолированный I _Ub был полностью деубиквитинирован в течение 30 минут под действием USP1-UAF1 (фиг. 4D).Взятые вместе, последовательное действие убиквитинирования FANCD2 и FANCI приводит к стабильному комплексу ДНК I _Ub D2 _Ub , устойчивому к деубиквитинированию.

Вестерн-блотов реакций на фиг. 4A и 4B. Убиквитинированный His ₆ -3C-FANCD2 (D2Ub) был смешан с дцДНК длиной 50 нуклеотидов и либо с His ₆ -TEV-V5-FANCI (I), убиквитинированным His ₆ -TEV-V5-FANCI (IUb) или без белка; смеси белок-ДНК затем инкубировали либо с USP1-UAF1 (при 25 или 100 нМ), либо с USP7 (100 нМ) или USP2 (100 нМ) в указанные моменты времени.Деубиквитинирование D2 _Ub и I _Ub оценивали после SDS-PAGE с помощью вестерн-блоттинга перенесенных блотов со специфическими антителами FANCD2 и V5 / FANCI.

Обсуждение

Моноубиквитинирование как FANCI, так и FANCD2 является ключевым этапом на пути FA. Здесь мы продемонстрировали отдельные функции для двух событий моноубиквитинирования, происходящих в комплексе ID2. Было обнаружено, что убиквитинирование FANCD2 модулирует аффинность связывания ID2-дцДНК, тогда как убиквитинирование FANCI в значительной степени защищает убиквитинированный комплекс ID2 от деубиквитинирования.Простое объяснение наших данных состоит в том, что комплекс ID2 может исследовать две разные конформационные крайности: открытое состояние, как в ранее описанных неубиквитинированных кристаллических структурах ID2 и ЭМ картах [12,18,32], и закрытое состояние, как наблюдается здесь (Рисунок 5). Мы предполагаем, что связывание ДНК позволяет ID2 достичь закрытой конформации ID2, в которой формируется интерфейс Arm ID2. Это конформационное изменение, вероятно, обнажает целевой лизин FANCD2, а также прилегающий к нему кислотный участок [25], что делает возможным стыковку Ube2T и последующее убиквитинирование FANCD2; последняя модификация стабилизирует закрытое состояние.Однако действие USP1-UAF1 внутри ячейки позволит популяции ID2 _Ub вернуться в открытое состояние через нестабильное закрытое состояние деубиквитинированного ID2. Последовательное убиквитинирование FANCI может гарантировать, что большая часть популяции ID2 существует в закрытом состоянии, поскольку I _Ub D2 _Ub в значительной степени защищен от активности USP1-UAF1. Следовательно, убиквитинирование FANCD2, по-видимому, усиливает связывание ID2-ДНК за счет достижения закрытого состояния, в то время как убиквитинирование FANCI действует для поддержания этого закрытого состояния (и, следовательно, более высокого сродства к ДНК), нарушая деубиквитинирование.В результате ожидается, что последовательное действие убиквитинирования FANCD2 и FANCI «заблокирует» комплекс ID2 на ДНК. Поскольку аргинин 1285 FANCI расположен рядом с наблюдаемым интерфейсом Arm ID2 в наших криоЭМ-структурах, ожидается, что мутация R1285Q на FANCI нарушит этот интерфейс, подавляя закрытое состояние ID2 и последующие события убиквитинирования, которые зависят от этого (рис. 5).

Модель, показывающая, как взаимодействие ID2 с ДНК и последующее убиквитинирование FANCD2 и FANCI может обогатить молекулы ID2, присутствующие в конформации закрытого плеча: взаимодействие ID2 с ДНК предлагается для обеспечения динамического равновесия, при котором ID2 может существовать как в открытой, так и в закрытой конформации. Убиквитинирование FANCD2 с помощью Ube2T и комплекса FA-core в состоянии закрытой конформации ID2 может сдвинуть это равновесие в пользу закрытой конформации, при этом действие USP1-UAF1 противодействует такому сдвигу.Когда FANCI также убиквитинируется Ube2T и комплексом FA-core, оба убиквитина в значительной степени устойчивы к деубиквитинированию USP1-UAF1, и, таким образом, дважды убиквитинированный ID2 может оставаться в закрытой конформации. Последняя конформация имеет более жесткое сродство к ДНК и, следовательно, фиксирует ID2 на ДНК. Мутация R1285Q в FANCI, вероятно, ограничивает образование закрытой конформации ID2, что, в свою очередь, отрицательно влияет на убиквитинирование ID2 и закрепление на ДНК.

Здесь мы показываем, что убиквитинирование FANCD2 внутри комплекса ID2 приводит к усилению связывания ДНК и конформации, которая окружает ДНК в закрытом состоянии.Усиление связывания ДНК и закрытого состояния, наблюдаемое при убиквитинизации, подтверждается тремя недавними исследованиями [33–35], которые включают криоЭМ-структуры ДНК человека I _Ub D2 _Ub и куриного ID2 _Ub -ДНК [33, 34]. В целом, наши данные и эти недавние исследования показывают, что убиквитинирование FANCD2 необходимо для формирования закрытого состояния для комплекса ID2. В структуре I _Ub D2 _Ub -ДНК [33], R1285 FANCI действительно находится внутри интерфейса Arm ID2 и образует солевой мостик с FANCD2 Q1365.Используя наш подход восстановления, мы можем надежно контролировать статус убиквитинирования каждого белка и определить, что I ^R1285Q D2 _Ub снижает усиленное связывание ДНК, наблюдаемое при убиквитинировании FANCD2, потенциально за счет уменьшения образования закрытого состояния. Кроме того, мы обнаружили, что убиквитин FANCI не обеспечивает дальнейшего усиления связывания ДНК.

Биологические последствия зависящей от убиквитинирования блокирования ID2 и ДНК в настоящее время являются спекулятивными: эта блокировка может гарантировать, что комплекс ID2 должным образом рекрутируется в сайты остановки репликации, где ID2 может быть необходим.Однако в настоящее время неизвестно, способен ли комплекс с заблокированной ДНК I _Ub D2 _Ub скользить, распознавать конкретную структуру ДНК или выполнять другую неизвестную функцию, что приведет к концентрированным фокусам ID2, часто наблюдаемым в ядра ДНК-поврежденных клеток [7]. Тем не менее, наша модель согласуется с наблюдаемым обогащением убиквитинированных форм FAND2 / FANCI хроматином [7,8]. Кроме того, наша модель предлагает последовательность событий, при которой сначала требуется FANCD2-убиквитинирование для достижения перехода к состоянию ID2 с более высокой аффинностью ДНК, а затем следует убиквитинирование FANCI для поддержания этого состояния.Это согласуется с наблюдениями, что убиквитинирование FANCI отстает от убиквитинирования FANCD2 in vitro [25,30].

Анализы in vitro [25,30] и клеточные [7] показали, что блокирование убиквитинирования FANCI также приводит к снижению убиквитинирования FANCD2. По нашим данным, это может происходить из-за того, что убиквитин FANCD2 уже недостаточно защищен от деубиквитинирования USP1-UAF1. Интересным наблюдением является то, что USP2 и USP7 обладают некоторой активностью по отношению к D2 _Ub , но эта активность теряется, когда последний образует комплекс с FANCI.Это указывает на то, что образование заблокированного комплекса ID2 _Ub -ДНК блокирует D2 _Ub от общей активности DUB. Однако USP1-UAF1 может деубиквитинировать комплексы ДНК ID2 _Ub и D2 _Ub в одной и той же степени. Следовательно, USP1-UAF1 способен обойти любую защиту, образованную заблокированным комплексом ID2 _Ub -ДНК. Только после того, как FANCI также убиквитинируется (образуя ДНК I _Ub D2 _Ub ), активность USP1-UAF1 в отношении D2 _Ub снижается.Эти данные предполагают, что USP1-UAF1 может быть способен модулировать комплекс ID2 _Ub -ДНК, чтобы получить доступ к убиквитину FANCD2. Хотя точные детали, с помощью которых это достигается, неизвестны, наша недавняя работа показала, что FANCD2-связывающая последовательность, расположенная на N-конце USP1, необходима для деубиквитинирования ID2 _Ub -ДНК [29]. Тем не менее, наша работа здесь показывает, что эта способность USP1-UAF1 нарушается, когда FANCI также убиквитинируется. Эффект убиквитинирования FANCI может заключаться в том, что дважды убиквитинированный комплекс ID2 становится не поддающимся модуляции USP1-UAF1; например, путем стабилизации конформационного изменения ID2, индуцированного убиквитинированием FANCD2, или индукции дополнительных незначительных конформационных изменений, которые стабилизируют комплекс.Наши данные анализа деубиквитинирования с мутантами убиквитина I _Ub показывают, что убиквитин на FANCI взаимодействует с FANCD2, что согласуется с недавно опубликованной структурой ДНК I _Ub D2 _Ub . Следовательно, возможно, что убиквитинирование FANCI блокирует доступ USP1-UAF1 к сайту связывания FANCD2, который необходим для расщепления убиквитина на FANCD2. В подтверждение этого наша предыдущая работа показала, что делеция FANCD2-связывающей последовательности в USP1 сходным образом приводит к нарушению активности USP1-UAF1 в отношении FANCI-убиквитин-дефицитных комплексов ID2 _Ub -ДНК [29].

Образование устойчивого к USP1-UAF1 комплекса I _Ub D2 _Ub -ДНК, вероятно, служит увеличению периода полужизни in vivo димоноубиквитинированного комплекса ID2. Таким образом, создается пороговое событие, при котором после установки двух убиквитинов в комплекс ID2 последний выполняет свою функцию. Напротив, промежуточный комплекс ID2 _Ub является временным и быстро деубиквитинируется. Более того, мы наблюдаем, что FANCD2 деубиквитинируется USP1-UAF1 быстрее, чем FANCI в комплексе IUbD2 _Ub .Это наблюдение подразумевает, что может иметь место упорядоченный механизм деубиквитинирования, приводящий к комплексному промежуточному соединению IUbD2. Предыдущая работа показала, что когда ДНК удаляется из реакции, димоноубиквитинированный ID2 больше не устойчив к деубиквитинированию под действием USP1-UAF1 [29,30], но в настоящее время неясно, как ДНК может защищать I _Ub D2 _Ub от деубиквитинирования USP1-UAF1. Одна возможность состоит в том, что в отсутствие ДНК убиквитинированный FANCD2 диссоциирует от убиквитинированного FANCI, и известно, что изолированно оба белка чувствительны к активности USP1-UAF1 [29].Однако влияние связывания ДНК на взаимодействие между FANCI и FANCD2 в различных состояниях убиквитинирования неизвестно и требует описания помимо моделей связывания 1: 1. Тем не менее, удаление ДНК может быть эффективным способом достижения быстрого деубиквитинирования ID2 и выключения этого пути. Это может быть достигнуто в клеточном контексте путем экстракции убиквитинированных комплексов ID2 с помощью сегрегазы DVC1-p97 [36] и последующего деубиквитинирования с помощью USP1-UAF1. Дальнейшая работа потребуется для понимания последовательности событий, ДНК-зависимости и того, когда другие факторы участвуют в деубиквитинизации I _Ub D2 _Ub .

Здесь мы обнаружили различные функции для двух конкретных событий моноубиквитинирования на FANCI и FANCD2 в комплексе ID2. Мы обнаружили, что убиквитинирование FANCD2 усиливает связывание комплекса ID2 с дцДНК, а убиквитинирование FANCI защищает комплекс от деубиквитинирования с помощью USP1-UAF1. В совокупности оба события приводят к стабильному комплексу ID2 на дцДНК.

Материалы и методы

Клонирование и мутагенез экспрессионных конструкций

Конструкции, кодирующие человеческий FANCD2, имеющий N-концевой 3C-расщепляемый His ₆ -тег (His ₆ -3C-FANCD2), и человеческий FANCI, содержащий N -концевые метки His ₆ и V5, разделенные TEV-расщепляемым сайтом (His ₆ -TEV-V5-FANCI), были описаны ранее [26].Родственные конструкции FANCD2 и FANCI , кодирующие His ₆ -3C-FLAG-меченные белки FANCD2 или His ₆ -FANCI, были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза. Мутация R1285Q была введена в His ₆ -FANCI посредством сайт-направленного мутагенеза в соответствующей конструкции FANCI . Человеческий USP7 лигировали в вектор pFBDM путем рестрикционного клонирования для кодирования His ₆ -3C-USP7. На N-конце His ₆ -TEV-меченых USP1 (с мутированным сайтом авторасщепления G670A / G671A [37]) и UAF1 были получены путем последовательной вставки кДНК человека USP1 и UAF1 в соответствующий вектор pFBDM путем рестрикции. клонирование.Обо всех других конструкциях сообщалось ранее [25,26,29]. Кодирующие области всех конструкций проверяли секвенированием ДНК.

Экспрессия и очистка белка

Все конструкции FANCI и FANCD2 были экспрессированы в клетках насекомых Sf21 и очищены с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA, анионообменной и гель-фильтрации, как описано ранее [26]. В некоторых случаях метка His ₆ удалялась из His ₆ -3C-FANCD2 или His ₆ -3C-FLAG-FANCD2 путем расщепления 3C протеазой перед стадией гель-фильтрации.Убиквитинированные FANCI и FANCD2 были продуцированы и очищены после реакций in vitro с меченным Spy-3C убиквитином, ковалентного связывания убиквитинированных белков с GST-меченным SpyCatcher, захвата образующихся продуктов на гранулах глутатиона и последующего расщепления убиквитинированных белков с помощью 3C-протеина. лечение, как описано ранее [26]. Для убиквитинированного His ₆ -TEV-V5-FANCI и Flag-FANCD2, используемых в EMSA, стадии, включающие реакцию с убиквитином, меченным Spy-3C, и последующее ковалентное связывание убиквитинированных белков с GST-SpyCatcher, были заменены реакциями с Убиквитин, меченный GST-3C.Обработка 3C-протеазой убиквитинированного FANCD2 также привела к удалению шестигистидиновой метки из убиквитинированных конструкций FANCD2. После заключительной стадии гель-фильтрации очищенные белки в буфере GF (20 мМ Tris pH 8,0, 400 мМ NaCl, 5% глицерин, 5 мМ DTT или 0,5 мМ TCEP) криоохлаждали в жидком азоте в виде аликвот для одноразового использования. Мутант His ₆ -FANCI R1285Q экспрессировали и очищали так же, как и мутант дикого типа.

Получение бакмид и экспрессии белка в клетках насекомых S f 21 для USP1-UAF1 и USP7 выполняли, как ранее описано для FANCI и FANCD2 [26].Все этапы после сбора клеток и перед хранением белка выполнялись при 4 ° C. Клетки собирали через ~ 72 часа после инфицирования бакуловирусом. Клетки осаждали центрифугированием, а осадок клеток ресуспендировали в свежем ледяном буфере для лизиса (50 мМ Трис pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5% глицерин, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 10 мМ имидазол, коктейль из ингибиторов протеазы без ЭДТА (Pierce ), 2 мМ MgCl ₂ и бензоназа). Клетки лизировали ультразвуком и осветляли (32000 х г в течение 45 мин) перед связыванием белков со смолой Ni-NTA.Ni-NTA-связанный His6-TEV-меченный комплекс USP1-UAF1 и меченный His6-3C USP7 дополнительно промывали 50 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 1 мМ TCEP, 10 мМ имидазола и затем элюировали в низкосолевой раствор. буфер (50 мМ Трис pH 8,0, 100 мМ NaCl, 5% глицерин, 1 мМ TCEP), содержащий 250 мМ имидазол. Анионный обмен выполняли как для USP1-UAF1, так и для USP7 путем связывания белков с колонкой ResourceQ (1 мл) и элюирования в линейном градиенте (20 объемов колонки) NaCl (100-1000 мМ) в 20 мМ Трис, pH 8,0, 5%. глицерин, 1 мМ TCEP.Фракции, содержащие USP1-UAF1, обрабатывали протеазой His-TEV в течение ночи (соотношение протеазы 1:10 к меченному белку). Его ₆ -TEV, меченная протеазой USP1 и His ₆ -TEV, была связана со смолой Ni-NTA, расщепленный комплекс USP1-UAF1 собирали в проточном потоке. Чтобы удалить избыток USP1, расщепленный USP1-UAF1 затем концентрировали и дополнительно очищали с использованием колонки GL 10/300 Superdex 200 Increase в 20 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5% глицерине, 5 мМ DTT. Фракции пика, содержащие интересующий белок, концентрировали до ~ 5 мг / мл и охлаждали в жидком азоте в виде аликвот одноразового использования.Для His ₆ -3C, меченного USP7, белок концентрировали и подвергали двум циклам гель-фильтрации с использованием колонки GL 10/300 Superdex 200 Increase в 20 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 5 мМ DTT. Центр асимметричного пика гель-фильтрации для USP7 собирали в первом прогоне и снова очищали с помощью гель-фильтрации, последний пик был симметричным и концентрировался до ~ 5 мг / мл для мгновенного замораживания в виде аликвот одноразового использования в жидком азоте.

GST-USP2 был очищен, как описано ранее, и тег GST был сохранен [29].Реагенты убиквитинирования белков (Uba1, Ube2T / Ube2Tv4, FANCL ^109-375 ) получали, как описано ранее [26]. Концентрации белка определяли с использованием оптической плотности при 280 нм и прогнозируемых коэффициентов экстинкции на основе последовательностей белков [38].

ДНК-субстраты

700IRDye-меченая дцДНК (ds32 ^F ) была получена отжигом двух комплементарных 32-нуклеотидных очищенных с помощью ВЭЖХ 5′-концевых 700IRDye-меченых молекул ДНК-оцДНК. Немеченая дцДНК (ds32 и ds50) была получена отжигом двух очищенных с помощью PAGE комплементарных молекул оцДНК (длиной 32 или 50 нуклеотидов).ОцДНК длиной 64 нульцеотида (ss64) очищали аналогичным образом в ПААГ. Вышеупомянутые дцДНК были приобретены у Integrated DNA Technologies в их окончательно очищенной и / или отожженной форме, затем ресуспендированы при соответствующих исходных концентрациях в дистиллированной воде и хранили при -20 ° C до использования. оцДНК была приобретена у Sigma Aldrich, ресуспендирована при соответствующих исходных концентрациях в 10 мМ Трис pH 8,0, 25 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА и хранилась при -20 ° C до использования. Подробные сведения о последовательностях всех используемых олигонуклеотидов представлены в таблице S1.

ДНК-субстратов

Оценка убиквитинирования FANCI / FANCD2 или последующего деубиквитинирования с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси или вестерн-блоттинга

Неубиквитинированные / деубиквитинированные белки FANCI или FANCD2 отличались от соответствующих убиквитинированных продуктов с помощью SDS / SDS-белка Novell. 4-12% трис-глициновых гелей (ThermoFisher) и последующее окрашивание гелей красителем InstantBlue Coomassie (Expedon). Все образцы, загруженные для SDS-PAGE (~ 300 нг FANCD2 для окрашивания Кумасси и ~ 100 нг для вестерн-блоттинга), сначала разбавляли восстанавливающим буфером LDS [состоящим из буфера NuPAGE 4x LDS (ThermoFisher) и соответствующей концентрации бета-меркаптоэтанола] до 1x LDS и 100 мМ бета-меркаптоэтанол или 100 мМ DTT в конце, а затем нагревают в течение 2 мин при 100 ° C.Для оценки прогресса деубиквитинирования убиквитинированные / деубиквитинированные FANCI и FANCD2 были дополнительно визуализированы с помощью вестерн-блоттинга. Белки, разделенные SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью устройства для переноса геля iBlot (Invitrogen), установленного на P0 (20 В 1 мин, 23 В 4 мин, 25 В 2 мин) и блокировали 5% молочным PBS-T (0,05% tween 20) перед инкубацией с кроличьим анти-FANCD2 1: 1000 (sc-28194; Santa Cruz Biotechnology) и мышиным анти-FANCI 1: 100 (sc-271316; Santa Cruz Biotechnology) или анти-V5 (66007.1-Ig; ProteinTech) в течение 60 минут при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. Мембраны тщательно промывали PBS-T, инкубировали со вторичными антителами, меченными инфракрасным излучением (Li-Cor), в течение 90 минут при комнатной температуре, а затем снова тщательно промывали PBS-T. Полосы визуализировали на Odyssey CLx (Li-Cor) с использованием канала 700 или 800 нм.

Анализы убиквитинирования

Убиквитинирование изолированного FANCI проводили с использованием His ₆ -FANCI или His ₆ -FANCI ^R1285Q (2 мкМ) в качестве субстрата в присутствии или в отсутствие одноцепочечной ДНК (ss64; 4) мкМ; таблица в приложении S1).Реакции проводили с использованием His ₆ -Uba1 (50 нМ), His ₆ -убиквитина (5 мкМ), Ube2Tv4 (2 мкМ) и FANCL ^109-375 (2 мкМ) в конечном реакционном буфере 49 мМ. Трис pH 8,0, 120 мМ NaCl, 5% глицерин, 1 мМ DTT, 2,5 мМ MgCl ₂ , 2,5 мМ АТФ. Убиквитинирование ID2 или I ^R1285Q D2 проводили в присутствии двухцепочечной ДНК (ds50; таблица S1 приложения). Реакции готовили разбавлением всех компонентов реакционным буфером E3 (50 мМ Трис, pH 8.0, 75 мМ NaCl, 5% глицерина, 5 мМ MgCl ₂ и 2,5 мМ АТФ) с получением конечных концентраций 4 мкМ FANCI (His ₆ -FANCI или His ₆ -FANCI ^R1285Q ), 4 мкМ His ₆ -3C-FANCD2, 16 мкМ ds50, 4 мкМ Ube2Tv4, 4 мкМ FANCL ^109-375 , 100 нМ His ₆ -Uba1 и 8 мкМ убиквитин. Все реакции проводили при комнатной температуре и останавливали в указанные моменты времени добавлением восстанавливающего буфера LDS (1x конечная концентрация).

Анализы деубиквитинирования

Субстраты ID2 _Ub -ДНК и I _Ub D2 _Ub -ДНК были восстановлены путем смешивания соответствующего количества D2 _Ub , His ₆ -TEV-V5-FANCI или His ₆ -TEV-V5-I _Ub и ДНК (ds50; таблица S1 приложения) с образованием I / I _Ub : D2 _Ub : молярное соотношение ДНК 1: 1: 4.Субстрат D2 _Ub -ДНК получали таким же образом, но с буфером GF, заменяющим I / I _Ub . Субстраты разводили в буфере DUB (50 мМ Tris pH 8,0, 75 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 5% глицерин) на льду до концентрации 2 мкМ и инкубировали в течение не менее 15 мин. USP1-UAF1, USP7 или GST-USP2 получали при 2-кратных концентрациях в буфере DUB. Для инициирования реакций 2X субстрат смешивали 1: 1 с 2X DUB в реакционном объеме 10 мкл и реакции останавливали в указанные моменты времени добавлением 10 мкл восстанавливающего буфера 2X LDS.

Анализы DUB-step

His ₆ -TEV-V5-FANCI (4 мкМ) убиквитинировали с использованием Ube2Tv4 (4 мкМ), FANCL ^109-375 (4 мкМ), His ₆ -Uba1 (100 нМ), убиквитин дикого типа или мутантный (8 мкМ) и ДНК (ds50; 16 мкМ). Все компоненты реакции (кроме убиквитина) сначала разбавляли с использованием реакционного буфера E3 (50 мМ Трис, pH 8,0, 75 мМ NaCl, 5% глицерин, 5 мМ MgCl ₂ и 2,5 мМ АТФ), после чего реакции инициировали добавлением убиквитина при комнатная температура.Реакции останавливали в указанные моменты времени добавлением 5 ед / мл апиразы (New England Biolabs) и последующей инкубацией на льду в течение 5 минут. Убиквитинированный FANCI затем смешивали в соотношении 1: 1 с очищенным D2 _Ub (2 мкМ ID2, 8 мкМ ДНК) и инкубировали еще 15 мин на льду. Восстановленные комплексы, D2 _Ub , I _Ub -ДНК или I _Ub D2 _Ub -ДНК, затем подвергали деубиквитинизации под действием USP1-UAF1 (конечные концентрации 100 нМ USP1-UAF1, 1 мкМ субстрата) в 10 мкл реакционных объемов в течение указанного времени при комнатной температуре.Реакции останавливали добавлением восстанавливающего буфера LDS (1x конечная концентрация).

Анализы сдвига электроподвижности (EMSA)

Указанные конструкции FANCI и FANCD2 объединяли при эквимолярных концентрациях, серийно разводили в буфере GF и каждое разведение смешивали с реакционным буфером EMSA для получения конечных концентраций 2 нМ меченой ДНК (ds32 ^F ; Таблица в приложении S1), 16 мМ трис-HCl, pH 8, 150 мМ NaCl, 4,4% глицерина, 0,07 мг / мл БСА, 7 мМ DTT, 4 мМ EDTA и концентрации ID2 в диапазоне от 4 до 512 нМ.Реакции (конечные 18 мкл) происходили на льду в течение 20 минут перед добавлением 2 мкл 10-кратного оранжевого красителя. Затем 10 мкл загружали в гели 4% полиакриламида 0,5x TBE, которые предварительно обрабатывали в буфере 0,5x TBE, и проводили электрофорез при 135 В в течение 40-45 минут. Затем гели сканировали в системе визуализации Li-Cor (Odyssey CLx) с использованием лазера 700 нм. Процент связанной ДНК определяли как отношение сигнала связанной с белком к общему сигналу ДНК на дорожку.

Усиление индуцированной белком флуоресценции

Для измерения связывания ДНК, аликвоты FANCI (His ₆ -FANCI или His ₆ -TEV-V5-FANCI), His ₆ -3C-FANCD2 или убиквитинированных версий в буфере GF размораживали на льду, затем смешивали в молярном соотношении 1: 1 с образованием каждого отдельного комплекса ID2.Затем образцы заменяли на буфер флуоресценции (20 мМ Трис pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5% глицерин, 0,47 мг / мл БСА, 1 мМ DTT) путем 5-кратного разбавления 20 мМ Трис pH 8,0, 87,5 мМ NaCl, 5%. глицерин, 0,59 мг / мл БСА. В пробирках для ПЦР с буфером флуоресценции проводили двукратные серийные разведения замененного белка. Меченую ДНК (ds32 ^F ), которую также разводили во флуоресцентном буфере, смешивали с каждым серийным разведением белка с получением конечной концентрации дцДНК 125 нМ.

Для измерения взаимодействия FANCI-FANCD2, аликвоты FANCD2 (происходящие из His ₆ -3C-FANCD2, в котором метка His ₆ расщеплена протеазой 3C) и His ₆ -FANCI или His ₆ -FANCI R1285Q размораживали на льду.Затем образцы заменяли на буфер флуоресценции путем 5-кратного разбавления 20 мМ Трис pH 8,0, 87,5 мМ NaCl, 5% глицерина, 0,59 мг / мл БСА. В пробирках для ПЦР с буфером флуоресценции готовили двукратные серийные разведения замененного FANCD2. 120 нМ замененного His ₆ -FANCI метили 50 нМ красителя RED-трис-NTA (Nanotemper) в буфере флуоресценции и добавляли к серийному разведению с получением конечной концентрации 60 нМ His ₆ -FANCI.

Для измерения связывания ДНК мутантов убиквитина FANCI в комплексе с D2 _Ub , His ₆ -TEV-V5-FANCI убиквитинировали в соответствии с анализами DUB-step (с использованием реакционного буфера 10 мМ Трис, pH 8.5, 75 мМ NaCl, 5% глицерина, 2,5 мМ MgCl ₂ и 2,5 мМ АТФ) и завершили добавлением 5 Ед / мл апиразы. 15 мкл этой реакционной смеси добавляли к 5 мкл His ₆ -FANCD2 _Ub (или буфера GF для контроля без D2 _Ub ) с получением конечной концентрации 3 мкМ I _Ub D2 _Ub . (или I _Ub ) и концентрацией NaCl ~ 150 мМ. Двукратные серийные разведения этого комплекса были подготовлены в подходящем буфере (включая все компоненты реакции за вычетом убиквитина), и каждое было смешано в соотношении 1: 1 с меченой ДНК (ds32 ^F ; 250 нМ) в буфере флуоресценции для получения конечная концентрация дцДНК 125 нМ.

Перед измерением флуоресценции образцы ненадолго центрифугировали, затем переносили в высококачественные капилляры (NanoTemper Technologies). Измерения проводили при 22 ° C на приборе Monolith NT.115 (NanoTemper Technologies) с использованием красного канала. Мощность лазера была установлена ​​на 20% и 40% для связывания ДНК и связывания FANCD2 соответственно.

Подбор данных связывания

Сродство связывания и связанные с ним неопределенности были определены с помощью GraphPad Prism путем подбора модели связывания с одним сайтом:

Где Y — это либо изменение флуоресценции (в случае PIFE), либо процент связывания ДНК (в случае EMSAs), F ₀ — это базовая линия, которая установлена ​​на ноль, F ₁ — плато, [ A _T ] — постоянная концентрация флуоресцентной связывающей молекулы, а [ B _T ] — изменяющаяся концентрация другой связывающей молекулы / комплекса.Для кривой связывания на Фигуре 3F плато F ₁ было установлено на то же значение F ₁ , рассчитанное на Фигуре 1B. Предполагалось, что все наборы данных, построенные вместе, имеют одно и то же плато, то есть общее F ₁ .

КриоЭМ пробоподготовка

FANCD2 _Ub и His ₆ -TEV-V5-FANCI или His ₆ -TEV-V5-FANCI _{Аликвоты Ub} оттаивали и смешивали в молярном соотношении 1: 1, затем заменен на буфер EM (20 мМ Трис, pH 8.0, 100 мМ NaCl, 2 мМ DTT) с использованием обессоливающей колонки Zeba ^™ Spin 7K MWCO. Для I _Ub D2 _Ub -dsDNA, затем добавляли ds32 (таблица S1 приложения) в молярном соотношении 1: 1: 1 I _Ub : D2 _Ub : ДНК. Образцы разбавляли до 3 мкМ (I _Ub D2 _Ub -dsDNA) или 1,5 мкМ (ID2 _Ub ) комплекса. 3,5 мкл образца наносили на решетки с тлеющим разрядом (C-Flat 2/2 или Quantifoil 2/2), промокали в течение 2,5-3,5 секунд и охлаждали в жидком этане с использованием Vitrobot, работающего при влажности ~ 95% при 4.5 ° С.

Сбор данных CryoEM и обработка изображений

Для I _Ub D2 _Ub -dsDNA, 1846 фильмов были собраны на Titan Krios (Thermo Fisher Scientific), оборудованном детектором Falcon III, работающим в режиме счета с использованием программного обеспечения EPU (Thermo Fisher Scientific). Каждый фильм состоял из 60 кадров и корректировался по движению с взвешиванием дозы с использованием MotionCor2-1.1.0. Для образца ID2 ^Ub фильмы 1146 и 916 были собраны за два сеанса на 300 кВ CRYOARM (JEOL), оборудованном детектором DE64, работающим в режиме счета с использованием SerialEM [39].В каждом фильме было 39 кадров. Для обоих наборов данных коррекция CTF была выполнена с помощью gCTF [40]. Более подробная информация о сборе данных представлена ​​в Приложении Таблица S2.

Сбор данных CryoEM

Обработка подпоследовательностей выполнялась с использованием RELION 3.0 или 3.1 [41]. Для набора данных I _Ub D2 _Ub -dsDNA приблизительно 5000 частиц были вручную отобраны и использованы для создания средних значений 2D класса без ссылок. Затем выбранные средние по классам использовались в качестве шаблонов для автоматического выбора частиц.Было извлечено 350 878 частиц, и было использовано пять циклов усреднения 2D-класса без эталонных данных для удаления плохих частиц. Первоначальная модель была сгенерирована с использованием стохастического градиентного спуска с последующим одним раундом 3D-классификации с 6 классами. Затем частицы из класса с наивысшим расчетным разрешением (12710) были использованы в 3D-уточнении. Затем была сгенерирована маска и выполнена постобработка. Для набора данных ID2 _Ub частиц было вручную отобрано 7 793 частицы, и был проведен один цикл безреференсной двухмерной классификации для удаления плохих частиц.Первоначальная модель была сгенерирована с использованием стохастического градиентного спуска, за которым последовал один раунд 3D-классификации с двумя классами. Затем частицы из лучшего класса (2 973) были использованы для 3D-обработки.

ID2-структура мыши (PDB: 3S4W) [18] была вписана в качестве твердого тела в окончательную карту I _Ub D2 _Ub -dsDNA с использованием UCSF Chimera [42]. Гибкая подгонка атомов Cα была впоследствии выполнена с использованием iMODFIT [28], включая ограничения вторичной структуры и используя данные до 17 Å.Затем подобранная структура ID2 была использована для создания карты при 12 Å, которая была вычтена из экспериментальной карты с использованием UCSF Chimera для определения разницы в плотности.

Дифференциальные функции убиквитинирования FANCI и FANCD2 стабилизируют комплекс ID2 на ДНК

Ренни, М. Л., Лемонидис, К., Аркинсон, К., Чогуль, В. К., Кларк, М., Стритли, Дж., Спаньоло, Л. и Уолден, Х. (2020) Дифференциальные функции убиквитинирования FANCI и FANCD2 стабилизируют комплекс ID2 на ДНК. EMBO Reports , 21 (7), e50133. (DOI: 10.15252 / embr.202050133) (PMID: 32510829) (PMCID: PMC7332966)

Abstract

Путь анемии Фанкони (FA) — это специальный путь для репарации межцепочечных сшивок ДНК, который дополнительно активируется в ответ на другие формы репликационного стресса. Ключевым этапом пути FA является моноубиквитинирование каждой из двух субъединиц (FANCI и FANCD2) комплекса ID2 на определенных остатках лизина.Однако молекулярная функция этих модификаций была неизвестна в течение почти двух десятилетий. Здесь мы обнаруживаем, что убиквитинирование FANCD2 действует, чтобы увеличить сродство ID2 к двухцепочечной ДНК посредством содействия крупномасштабным конформационным изменениям в комплексе. Полученный комплекс окружает ДНК, образуя вторичный интерфейс «рука» ID2. Убиквитинирование FANCI, с другой стороны, в значительной степени защищает убиквитин на FANCD2 от деубиквитинирования USP1-UAF1, при этом ключевые гидрофобные остатки убиквитина FANCI важны для этой защиты.Фактически, обе эти посттрансляционные модификации функционируют, чтобы стабилизировать конформацию, в которой комплекс ID2 окружает ДНК.

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Рекомбинантный ингибитор связывания ДНК Id2 формирует мультимерные структуры через домен спираль-петля-спираль и сигнал ядерного экспорта

2.1. Масс-спектрометрия рекомбинантного белка Id2

2.2. CD Spectroscopy

2.3. ЯМР-спектроскопия

Таким образом, исследование ЯМР лиофилизированного белка Id2 » в чистой воде и в присутствии 30% TFE показало, что белок существует в самоассоциированной форме (в среднем 16меров), что препятствует выяснению структуры HLH и РЭШ регионов.Напротив, при оценке вторичных химических сдвигов N-конца, а также C-концевых частей, фланкирующих последовательность NES, эти области оказались очень гибкими, без четко определенной вторичной структуры, но со способностью образовывать временные вторичные элементы конструкции в подходящей среде.

2.4. Динамическое рассеяние света

2,5. ATR-FTIR-спектроскопия.

52 EUR Blokzijl Geertien — Размещение в отеле

Номера оформлены в строгом стиле и оснащены спутниковым телевидением и бесплатным Wi-Fi. Из некоторых номеров открывается вид на озеро. В каждом номере есть собственная ванная комната с душем и ванной, а также бесплатными туалетно-косметическими принадлежностями.

В отеле есть 2 ресторана, в которых для приготовления меню используются свежие сезонные продукты.К блюдам прилагается обширная карта вин. Завтрак предоставляется по запросу. Также имеется традиционный голландский бар.

Отель и ресторан Geertien расположен в сельской местности, и гости могут расслабиться, прогуливаясь пешком, покатавшись под парусами или покатавшись на велосипеде. Город Блокзейл находится в 4 км, а город Волленхове — в 10 км.

Описание салона:

Интернет: Бесплатно! Wi-Fi предоставляется на всей территории бесплатно.

Парковка: Бесплатная общественная парковка на территории (предварительный заказ не требуется).

Примечание к цене:
Заезд:

15:00 — 22:00 ..

Расчетный час:

08:00 — 11:30 часов

Отмена / предоплата
Правила отмены бронирования и предоплаты зависят от типа номера. Пожалуйста, проверьте условия проживания при выборе номера выше.

Дети и дополнительные кровати::

Все дети до 5 лет размещаются бесплатно на имеющихся кроватях.При размещении всех детей младше 2 лет на детских кроватках взимается EUR 11 с человека за ночь. При размещении всех детей старшего возраста или взрослых на дополнительных кроватях взимается EUR 11 с человека за ночь. Максимальное количество дополнительных кроватей / детских кроваток, разрешенных в номере, составляет 1. Доплаты не включаются автоматически в общую стоимость и оплачиваются отдельно при выезде.

Домашние животные::

Домашние животные разрешены. Может взиматься дополнительная плата. Доплаты не включаются автоматически в общую стоимость и оплачиваются отдельно при выезде.

Принимаемые кредитные карты::

American Express, Visa, Euro / Mastercard, Diners Club, PIN, Maestro. Отель оставляет за собой право провести предварительную авторизацию кредитной карты до прибытия. Доплаты не включаются автоматически в общую стоимость и оплачиваются отдельно при выезде.