При активации: Если не удается включить iMessage или FaceTime или выполнить вход в эти службы

{{article.content_lang.display}}

Результаты активации продукта SOLIDWORKS — 2020

На этом экране отображаются результаты активации продукта SOLIDWORKS (активация, деактивация или отображение лицензий).

Результат

При просмотре активированных лицензий (для перехода к этому экрану необходимо выбрать пункт меню в SOLIDWORKS) параметр Результат не отображается.

Активированные продукты

• После активации лицензий отображаются все продукты SOLIDWORKS, которые были активированы во время текущего сеанса.

  В данном списке отображаются только те продукты, активация которых состоялась во время данного сеанса. В списке отсутствуют продукты, которые были активированы ранее, во время предыдущих сеансов. Для просмотра всех активированных продуктов, имеющихся на данном компьютере, закройте данный экран и выберите пункт меню в программе SOLIDWORKS.

• После деактивации лицензий список будет пустым, так как в этом сеансе не выполнялась активация лицензий SOLIDWORKS.

Если выбрано отображение лицензий, в списке Текущие активированные продукты отображаются активированные лицензии на этом компьютере.

Вступить в сообщество SOLIDWORKS

Чтобы подписаться на абонентские услуги для участников сообщества пользователей SOLIDWORKS, нажмите кнопку Присоединяйтесь к нам!

Для получения дополнительных сведений о том, как стать участником сообщества пользователей SOLIDWORKS, посетите веб-сайт www.solidworks.com.

Продолжение

При активации или деактивации лицензии нажмите Готово, чтобы закрыть экран Активация продукта SOLIDWORKS. Для продолжения работы с остальными лицензиями продуктов SOLIDWORKS можно нажать кнопку Назад.

Кнопка Назад недоступна. Чтобы активировать или деактивировать лицензии, необходимо закрыть этот экран и выбрать пункт меню или в программе SOLIDWORKS.

PS3™ | Активация системы

Активация системы — это процедура, призванная защитить авторские права и прочие цифровые права. Материалы и приложения, доступные для загрузки в PlayStation®Store, можно использовать только на активированных системах.

Вы можете связать свою учетную запись Sony Entertainment Network с несколькими системами, но число систем, которые можно активировать для каждого типа материалов, ограничено. Когда число активированных систем достигнет предела, при попытке загрузить (приобрести) материал с помощью неактивированной системы отобразится сообщение об ошибке. Для того чтобы воспользоваться материалами на этой системе, вам сначала нужно будет деактивировать одну из систем.

Ручная активация системы

Обычно система автоматически активируется при загрузке (приобретении) материала. Если же при попытке воспроизведения материала появляется сообщение о том, что необходимо провести активацию системы, вам нужно активировать эту систему вручную.

Войдите в свою учетную запись PSN^SM на системе PS3™. Выберите (PlayStation™Network) > (Управление учетной записью) > (Активация системы), затем следуйте указаниям на экране.

Подсказки

• Вы можете активировать систему PS3™ для просмотра видеосодержимого максимум 3 раза в течение 90 дней для каждой учетной записи. Вы не можете использовать учетную запись для активации той же системы в четвертый раз в течение 90 дней. Вы сможете активировать систему снова через 90 дней с момента первой активации.
• Продажа и прокат видеоматериалов из PlayStation®Store для системы PS3™ прекращены.

Деактивация системы

Если вы превысите допустимое для вашей учетной записи число активированных систем, появится сообщение о том, что приобрести (загрузить) выбранный материал невозможно. Если такое произойдет, деактивируйте одну из систем.

Войдите в свою учетную запись PSN^SM на системе PS3™. Выберите (PlayStation™Network) > (Управление учетной записью) > (Активация системы), затем следуйте указаниям на экране.

Если нет возможности деактивировать систему

Если вы не можете деактивировать систему с помощью этой же системы — например, из-за технической неисправности или потому что вы ее выбросили, — обратитесь в службу технической поддержки в вашем регионе.
Вы также можете деактивировать все системы для каждого типа материалов через веб-сайт:

http://account.sonyentertainmentnetwork.com/
В меню [Учетная запись] > [Медиа и устройства] выберите [Деактивировать все] для того типа материалов, для которого вы хотите деактивировать все активированные системы.

Подсказки

• Для некоторых типов материалов не предусмотрена возможность деактивации всех систем через эту страницу.
• Этот сайт доступен не во всех странах или регионах.

Вопросы и ответы / Портал госуслуг Москвы

Выберите темуАвтоплатежи по выставленным счетам за текущий ЕПД, МГТС, детский сад, кружки и секцииАвтоплатежи по расписаниюАвторизация и восстановление пароляАннулирование разрешения на установку и эксплуатацию рекламной конструкцииАренда городских пространствАренда спортивных площадокБесплатное получение земельного участка в собственность гражданами и юридическими лицамиВвод СНИЛСВключение места размещения нестационарного торгового объекта при стационарном торговом объекте в схему размещения нестационарных торговых объектов (внесение изменений в схему размещения)Внесение в реестр резидентных парковочных разрешенийВнесение изменений в договор аренды земельного участка для строительства (реконструкции) капитального сооруженияВнесение изменений в разрешение на строительство (городской округ Троицк)Внесение изменений в разрешение на строительство (городской округ Щербинка)Внесение изменений в разрешение на строительство (только для ОКН)Внесение изменений в разрешение на строительство (только для ООПТ)Внесение изменений в разрешение на установку и эксплуатацию рекламной конструкцииВнесение изменений в реестр лицензий по управлению многоквартирными домамиВозмещение затрат на адаптацию продукцииВозмещение затрат на подтверждение соответствия продукции (сертификация продукции)Возмещение затрат на получение охранных документов (патентов, свидетельств) на РИД и средства индивидуализацииВозмещение затрат на сертификацию соответствия систем менеджментаВыдача пропусков грузовикамВыдача разрешения на строительствоВызов мастера (подача заявки в ЕДЦ)Выкуп арендуемой недвижимости у города субъектами малого и среднего бизнеса Государственная экспертиза результатов инженерных изысканий и проектной документацииГрадостроительный план земельного участка городского округа ТроицкГрадостроительный план земельного участка городского округа ЩербинкаГрант в целях стимулирования развития субъектов малого и среднего предпринимательства, осуществляющих реализацию товаров за пределы территории Российской Федерации, экспорт результатов интеллектуальной деятельности и (или) услугДоговор на размещение объекта благоустройстваДополнительное соглашение об изменении договора аренды земельного участкаДополнительное соглашение об изменении договора аренды недвижимости, принадлежащей городу, за исключением земельных участков и жильяЕдиный платежный документ для нежилых помещенийЕжемесячная выплата в связи с рождением (усыновлением) первого ребенкаЕжемесячная городская денежная выплата, включающая компенсацию на оплату стационарного телефонЗадание (или его копия) на работы по сохранению объекта культурного наследия федерального значения (за исключением объектов, перечень которых устанавливается правительством РФ)Задание на работы по сохранению объекта культурного наследия регионального значения, выявленного объекта культурного наследияЗаключение о соответствии Сводному плану подземных коммуникаций и сооруженийЗаписаться на личный приём в МАДИЗапись в детский садЗапись в инспекцию ГостехнадзораЗапись в колледжЗапись в кружки, спортивные секции, дома творчестваЗапись в офис МОСГОРТУРЗапись в первый класс, перевод из одной школы в другуюЗапись к ветеринарному врачуЗапись на ЦПМПК г. МосквыЗапись на заключение договора по программе реновацииЗапись на медкомиссию для получения справки в ГИБДДЗапись на осмотр квартиры по программе реновацииЗапись на приёмЗапись на приём к нотариусуЗапись на прием в офис ГАУК «МОСГОРТУР»Запись на прием в центр «Моя карьера»Запись на прием к врачуЗапись на прием к нотариусу для участников программы реновацииЗапись на прием к экспертамЗапись на проведение контрольно-геодезической съемкиЗапись на регистрационный учет на территории Троицкого и Новомосковского административных округовЗапись на собеседование в Школу вожатыхЗапись на торжественное вручение первого паспортаЗапись на участие в ГИА (ЕГЭ, ОГЭ, ГВЭ), итоговом сочинении (изложении), итоговом собеседовании по русскому языку для 9 классовЗапись ребёнка в группу продлённого дняЗапрос на сверку расчетов по финансово-лицевому счетуЗапрос, изменение и отмена доступа к электронной медицинской картеЗаявление на устранение строительных дефектов в рамках переезда по программе реновацииИзменение разрешенного использования земельного участка Информация об очерёдности граждан, состоящих на жилищном учётеКарта москвича для студента/ординатора/аспиранта/ассистента-стажераКомпенсация взамен получения подарочного комплекта для новорожденныхКомпенсация платы за детский садКопии правоудостоверяющих, правоустанавливающих документовЛицензирование предпринимательской деятельности по управлению многоквартирными домамиЛицензирование розничной продажи алкогольной продукцииЛичный кабинетЛичный кабинет юридического лицаМОСВОДОКАНАЛ. Заключение договора о подключении к сетям холодного водоснабжения, водоотведения МОСВОДОКАНАЛ. Заключение дополнительного соглашения к договору о подключении объекта строительства к сетям водоснабжения и (или) водоотведенияМОСВОДОКАНАЛ. Получение акта о подключении к сетям холодного водоснабжения, водоотведенияМОСВОДОКАНАЛ. Получение технических условий подключения к сетям холодного водоснабжения, водоотведения МОСВОДОСТОК. Заключение договора о подключении (технологическом присоединении) к сетям водоотведения поверхностных сточных водМОСВОДОСТОК. Заключение дополнительного соглашения к договору о подключении объекта строительства к централизованной системе водоотведения поверхностных сточных водМОСВОДОСТОК. Получение акта о подключении к сетям водоотведения поверхностных сточных водМОСВОДОСТОК. Получение технических условий подключения к сетям водоотведения поверхностных сточных водМОСГАЗ. Заключение договора о подключении к сетям газораспределенияМОСГАЗ. Заключение дополнительного соглашения к договору о подключении (технологическом присоединении) объекта капитального строительства к сетям газораспределенияМОСГАЗ. Получение акта о подключении к сетям газораспределения МОСГАЗ. Получение технических условий подключения к сетям газораспределенияМОСОБЛГАЗ. Заключение договора о подключении к сетям газораспределенияМОСОБЛГАЗ. Заключение дополнительного соглашения к договору о подключении (технологическом присоединении) объекта капитального строительства к сетям газораспределенияМОСОБЛГАЗ. Получение акта о подключении к сетям газораспределенияМОСОБЛГАЗ. Получение технических условий подключения к сетям газораспределенияМОЭК. Заключение договора о подключении к сетям теплоснабженияМОЭК. Заключение дополнительного соглашения к договору о подключении (технологическом присоединении) к системам теплоснабженияМОЭК. Получение акта о подключении к сетям теплоснабженияМОЭК. Получение технических условий подключения к сетям теплоснабженияНазначение компенсации на приобретение технического средства реабилитации инвалидам за счет средств бюджета города МосквыНаправление декларации о характеристиках объекта недвижимостиНаправление обращения об исправлении ошибок, допущенных при определении кадастровой стоимостиНаправление предложений о внесении изменений в правила землепользования и застройки города МосквыНаше деревоОЭК. Заключение договора о технологическом присоединении к электрическим сетямОЭК. Заключение дополнительного соглашения к договору о подключении (технологическом присоединении) к электрическим сетямОЭК. Получение акта о технологическом присоединении к электрическим сетямОбщие вопросыОпределение вида фактического использования зданий и помещений в целях налогообложения и выдача копии актаОрганизация проведения оплачиваемых общественных работОрдер на производство земляных работ, установку временных ограждений и объектовОтзыв согласования переустройства, перепланировки помещения в многоквартирном домеОтказ от права постоянного (бессрочного) пользования либо пожизненного наследуемого владения земельным участкомОтправка замечаний к проекту отчета об итогах государственной кадастровой оценкиОформление (закрытие) порубочного билета и (или) разрешения на пересадку зеленых насажденийОформление полиса ОМСОформление приемочной комиссией акта о завершенном переустройстве, перепланировке помещения в многоквартирном домеПАО «Россети Московский регион». Заключение договора о технологическом присоединении к электрическим сетямПАО «Россети Московский регион». Заключение дополнительного соглашения к договору о подключении (технологическом присоединении) к электрическим сетям ПАО «Россети Московский регион». Получение акта о технологическом присоединении к электрическим сетямПарковочные разрешения для автомобилей системы каршерингаПарковочные разрешения для многодетных семейПаспорт колористического решения фасадов зданий, строений, сооруженийПередача в органы соцзащиты сведений об изменении банковских реквизитов и личных данныхПереезд по программе реновацииПерераспределение земель и (или) земельных участков, находящихся в государственной или муниципальной собственности, и земельных участков, находящихся в частной собственностиПодача апелляции о несогласии с выставленными баллами ГИА (ЕГЭ, ОГЭ, ГВЭ)Подача отчетности по долевому строительствуПодача сведений о поверке, вводе в эксплуатацию приборов учёта водыПодготовка, утверждение, изменение (переоформление) и отмена градостроительных планов земельных участковПодтверждение документов об образовании и (или) о квалификации, об ученых степенях, ученых званияхПоиск вакансий (работы)Поиск информации о ранее поданных заявлениях на предоставление государственных услугПоиск пропавших и найденных животныхПолучение архивной справки из государственных архивов МосквыПолучение земельного участка в безвозмездное пользованиеПолучение земельного участка в собственность собственником здания, сооруженияПолучение и оплата ЕПДПолучение информации жилищного учётаПолучение информации об эвакуированном транспортном средствеПолучение места на ярмарке выходного дняПолучение охотничьего билетаПолучение права постоянного (бессрочного) пользования земельным участкомПолучение разрешения на ввод объекта в эксплуатациюПолучение социальной карты учащегосяПолучение субсидии на оплату жилого помещения и коммунальных услугПомощь в переездеПосмотреть информацию о посещении и питании в школеПособия и компенсации семьям с детьми (в т.ч. многодетным)Постановка граждан льготных категорий, нуждающихся в санаторно-курортном лечении, на учет для получения бесплатной санаторно-курортной путевкиПредварительное согласование предоставления земельного участкаПредзапись на государственные услуги по регистрации автотранспортных средствПредоставление городских мер социальной поддержки в денежном выражении либо в виде социальных услугПредоставление ежемесячной денежной компенсации на оплату услуг местной телефонной связиПредоставление земельных участков в аренду правообладателям зданий, сооружений, расположенных на земельных участкахПредоставление информации и документов о зарегистрированных до 31 января 1998 г. правах на объекты жилищного фондаПредоставление информации из Сводного плана подземных коммуникаций и сооружений в городе МосквеПредоставление информации о результатах ГИА (ЕГЭ, ОГЭ, ГВЭ), итогового сочинения (изложения)Предоставление питания за счёт средств бюджета города МосквыПредоставление разъяснений, связанных с определением кадастровой стоимостиПредоставление сведений, содержащихся в ИАИС ОГДПриём показаний и оплата электроэнергииПриёмка исполнительной документации для ведения Сводного плана подземных коммуникаций и сооружений в городе МосквеПриватизация гражданами жилых помещений жилищного фонда города МосквыПрием показаний приборов учета водыПриемка результатов инженерных изысканий в ИАИС ОГДПрикрепление к детской стоматологической поликлиникеПрикрепление к женской консультацииПрикрепление к поликлиникеПрикрепление к стоматологической поликлиникеПрикрепление ребенка к детской поликлиникеПрисвоение гражданам статуса «Предпенсионер»Проверка и пополнение баланса домашнего телефона МГТСПродление срока действия согласования переустройства, перепланировки помещения в многоквартирном домеПросмотр результатов олимпиадыПубличные слушанияПутевки на отдых и оздоровление детейРазрешение (или его копия) на работы по сохранению объекта культурного наследия федерального значения (за исключением объектов, перечень которых устанавливается правительством РФ)Разрешение на ввод объекта в эксплуатацию (городской округ Троицк)Разрешение на ввод объекта в эксплуатацию (городской округ Щербинка)Разрешение на ввод объекта в эксплуатацию (только для ОКН)Разрешение на ввод объекта в эксплуатацию (только для ООПТ)Разрешение на использование земельных участков, которые принадлежат городу, либо государственная собственность на которые не разграниченаРазрешение на работы по сохранению объекта культурного наследия регионального значения, выявленного объекта культурного наследияРазрешение на строительство (городской округ Троицк)Разрешение на строительство (городской округ Щербинка)Разрешение на строительство (для ООПТ)Разрешение на строительство (только для ОКН)Разрешение на таксомоторную деятельностьРаспоряжение о снятии запрета на строительствоРассмотрение запроса (заявления) о принятии на учет в качестве нуждающихся в жилых помещениях/внесение изменений в учётное делоРегиональная социальная доплата к пенсииРегистрация аттракционаРегистрация граждан в целях поиска подходящей работы и в качестве безработных гражданРегистрация самоходных машин и прицепов к нимРегистрация физического лицаСведения о капитальном ремонтеСервис сверки финансово-лицевых счетов арендаторовСогласие на залог, переуступку прав аренды земельного участка либо субарендуСогласие на субаренду либо переуступку прав аренды недвижимости, принадлежащей городу (за исключением земельных участков и жилья)Согласование дизайн-проекта размещения вывескиСогласование межевого плана границ земельного участкаСогласование мероприятий по уменьшению выбросов вредных (загрязняющих) веществ в атмосферный воздух в периоды неблагоприятных метеорологических условийСогласование переустройства, перепланировки помещения в многоквартирном домеСогласование специальных технических условий для подготовки проектной документации объектов капитального строительстваСправка Гостехнадзора о совершенных регистрационных действияхСубсидии в целях возмещения затрат, возникших при перевозке (транспортировке) товаров от пунктов отправления на территории Российской Федерации до конечного пункта назначения на территории иностранного государстваСубсидии на возмещение части затрат на создание, развитие имущественного комплекса технопарка, индустриального паркаСубсидия на компенсацию затрат по приобретению оборудования и оплате коммунальных услугСубсидия на компенсацию затрат по продвижению собственных товаров, работ, услугСубсидия на компенсацию лизинговых платежейСубсидия на компенсацию процентов по кредитамСубсидия франчайзи на компенсацию затрат по приобретению оборудования, выплате вознаграждений по договору франшизы и оплате коммунальных услугСубсидия франчайзи на компенсацию лизинговых платежейСубсидия франчайзи на компенсацию процентов по кредитамТехнические вопросыТехнический осмотр самоходных машин и прицепов к нимУведомление о соответствии (несоответствии) завершенного строительства требованиям законодательства о градостроительной деятельностиУведомление о соответствии (несоответствии) параметров планируемого строительстваУведомление об изменении параметров планируемого строительстваУдостоверение тракториста-машиниста (тракториста)Установка рекламной конструкцииШтрафыЭлектронная медицинская картаЭлектронный дневник

Ошибка при активации программы

Перед тем, как приступить к активации программы ePochta, убедитесь, что ваш антивирус не блокирует файлы программы и что браузер Internet Explorer работает корректно.

Эти параметры желательно проверять перед регистрацией программы ePochta, чтобы лицензионная версия активировалась без ошибок.

Ошибки активации программы

Если во время активации программы ePochta у вас возникла одна из перечисленных ниже проблем:

• Программа не активируется. Service is temporarily unavailable.

• Вы активировали программу, но при перезапуске программа снова запускается в пробном режиме.

Воспользуйтесь пошаговой инструкцией, чтобы устранить ошибки активации программы ePochta.

Шаг 1. Проверить работу Internet Explorer

Шаг 2. Добавить программу в исключения антивируса

Шаг 1. Проверить работу Internet Explorer

Активация программы может не удаваться, если есть проблемы подключения к интернету браузера Internet Explorer.

В этом случае вам нужно проверить работу Internet Explorer.

1. Запустите браузер Internet Explorer, введите в адресную строку URL-адрес любого сайта и посмотрите, загружается ли сайт.
   Проверьте наличие интернета.

2. Если сайт не загружается, значит в работе Internet Explorer имеются неполадки, которые необходимо устранить.
   Рекомендуется обновить версию браузера до самой новой рабочей версии.
   Скачать обновленную версию Internet Explorer можно на официальном сайте.

Другие варианты устранения проблем в Internet Explorer читайте в инструкции «Действия в случае прекращения работы Internet Explorer».

Шаг 2. Добавить программу в исключения антивируса

Проблема может возникать по причине установленного на вашем компьютере антивируса, который считает файл программы вирусом.

Для решения этой проблемы необходимо занести файл программы в исключения антивируса.

* Ни в коем случае не отключайте антивирус!

• во-первых, ваш компьютер останется без защиты и может «заразиться» реальным вирусом

• во-вторых, отключение антивируса не решит проблемы, потому что после возобновления его работы, он по-прежнему будет распознавать файл вашей программы ePochta, как небезопасный.

! Правильное решение – добавить файл программы в исключения антивируса.

В этом случае во время проверки компьютера антивирус будет обходить указанный в исключениях файл программы, считая его безопасным.

Список файлов-исключений формируется в настройках антивируса.

Каждый антивирус имеет собственные уникальные настройки. Тем не менее, основной алгоритм подходит для каждого антивируса.

Ниже показан пример добавления файла в исключения на примере антивируса Avira.

1. Открываем настройки антивируса

Запустите главное окно антивируса и найдите пункт «Настройки», который открывает диалоговое окно настроек.

ИЛИ

Найдите в треке значок антивируса и кликните на нем правой кнопкой мыши. Среди пунктов открывшегося контекстного меню следует выбрать пункт «Настройка Avira».

(Соответственно, если у вас другой антивирус, то вы открываете его настройки.)

2. Находим в настройках раздел «Исключения», который отвечает за добавление файлов-исключений, и отрываем его.

3. Далее нам необходимо найти и добавить файл программы ePochta в список исключений.

Что касается антивируса Avira, то при нажатии кнопки «Обзор» открывается окно проводника для выбора файла программы, который планируется добавить в исключения (с указанием месторасположения: диска и папки).

Выберите файл и нажмите кнопку «Добавить».

В списке справа появится файл, добавленный в исключения, с прописанным полным путем к нему.

Если вы все сделали правильно и файл был добавлен в список доверенных файлов/список исключений, то антивирус будет исключать указанный файл из проверки на наличие вирусов.

При необходимости, добавленный в исключения файл можно удалить, выделив нужный файл в списке и нажав кнопку «Удалить».

Закончив работу с антивирусом, нажмите кнопку «ОК», чтобы принять все изменения в списке исключений.

Антивирус не дает добавить файл в список исключений?

Эту проблему можно решить, временно отключив защиту.
Не выключить антивирус, а именно отключить защиту!

Для этого, найдите значок антивирусной программы в треке и кликните по нему правой кнопкой мыши, вызвав контекстное меню.

В появившемся списке опций контекстного меню нужно снять галочку с пункта «Активировать Real-Time Protection».
(В зависимости от вашего антивируса, этот пункт может отличаться своими названиями)

Благодаря такому временному отключению защиты, вы сможете спокойно добавить файл в исключения.

Важно! Не забудьте после всех действий включить защиту!

Если вы исполнили все действия, указанные в этой статье и ваша программа по-прежнему не активируется, обратитесь с проблемой в Службой Технической Поддержки [email protected].

Чрезмерная активация субгенальной поясной коры приматов усиливает сердечно-сосудистые, поведенческие и нервные реакции на угрозу

Субъекты

Семь мартышек ( Callithrix jacchus , три самки и четыре самца), выведенные в колонии разведения мартышек Кембриджского университета были размещены парами самец / самка (самцы были подвергнуты вазэктомии). Все были экспериментально наивны в начале тестирования.

Животных содержали при 12-часовом цикле свет-темнота (свет включается в 7 а.м., свет выключается в 19:00) в контролируемой среде с температурой 22 ± 1 ° C и влажностью 50 ± 1%. Их клетки (2,80 x 1,20 x 0,98 м) содержали гнездовой ящик вместе с различными средствами обогащения окружающей среды, включая подвесные лестницы, деревянные ветки, веревки и ящики. Животные имели неограниченный доступ к воде и получали разнообразную диету, состоящую из рациона приматов MP.E1 (Special Diet Services, Эссекс, Великобритания), моркови, фруктов, сухарей, солодового хлеба, яиц и хлеба. Все процедуры были выполнены в соответствии с Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года и Органом по надзору за благополучием и этикой животных Кембриджского университета.

Хирургические процедуры

Всем животным были выполнены три асептических хирургических процедуры: одна для имплантации телеметрического монитора артериального давления в нисходящую аорту, вторая для имплантации внутримозговых канюль, нацеленных на sgACC / 25, и третья для имплантации порта доступа к сосудам для введения ¹⁸ F-FDG. После всех хирургических вмешательств животные выздоравливали в течение 7–10 дней.

Телеметрическая хирургия

Мартышек предварительно лечили кетамином (Кетавет; 10 мг / 0.1 мл в / м инъекция; Генри Шайн, Мелвилл, штат Нью-Йорк) перед приемом анальгетика карпрофена (1,5 мг / 0,03 мл п / к; Pfizer, Кент, Великобритания). Их интубировали и поддерживали на 2,0–2,5% изофлуране в 0,3 л / мин O ₂ . На протяжении всего времени за животными наблюдали с помощью пульсоксиметрии и капнографии (Microcap Handheld Capnograph, Oridion Capnography Inc., Массачусетс, США), а также ректального термометра, измеряющего внутреннюю температуру тела (цифровой термометр TES-1319 типа K, TES Electrical Electronic Corp, Тайбэй. , Тайвань).Нисходящую аорту визуализировали в брюшной полости, и зонд-катетер телеметрического передатчика артериального давления (HDS-10, Data Sciences International, США) имплантировали в аорту непосредственно над бифуркацией аорты. Кровоток перекрывали не более чем на 3 мин. Зонд вшили в брюшную полость. Все обезьяны получали мелоксикам (0,15 мг / 0,1 мл перорально; Boehringer Ingelheim) в послеоперационном периоде в течение трех дней в дополнение к профилактическому лечению антибиотиками амоксициллином и клавулановой кислотой (Synulox; раствор 50 мг / мл, Pfizer, Кент, Великобритания) за один день до и для через шесть дней после операции.

Операция по канюлированию

Животных, как и прежде, анестезировали и помещали в стереотаксическую рамку, модифицированную для мартышек (Дэвид Копф, Туджунга, Калифорния, США). Канюли (Plastics One, Роанок, Вирджиния, США) имплантировали в sgACC / 25 (двойные канюли размера 26, выступ 7,0 мм от основания направляющей, расстояние от 1,0 до 1,4 мм, переднезаднее [AP] + 12,5–13,8, латеромедиально). [LM] ± 0,7) с поправкой на месте в соответствии с глубиной кортикального слоя ⁵² . В послеоперационном периоде животным вводили обезболивающий мелоксикам, как указано выше.Канюли и держатель очищали еженедельно (и меняли колпачки и блокаторы канюль), чтобы гарантировать, что канюли проходимы, а место оставалось свободным от инфекции.

Операция по имплантации порта

Порт сосудистого доступа (Solomon Scientific, Скоки, Иллинойс, США) был имплантирован семи животным для быстрой подкожной инъекции ¹⁸ F-FDG. Животных анестезировали и помещали на хирургический стол в положении лежа. Был сделан разрез ниже лопаток перпендикулярно оси позвоночника, где должен был быть размещен порт, и второй разрез был сделан на шее, чтобы обнажить яремную вену.Катетер, прикрепленный к порту, вводили под кожу сзади по направлению к вене. Порт помещался в кожный карман, созданный после первого разреза. В яремной вене был сделан небольшой разрез, чтобы ввести открытый конец катетера в направлении сердца. Катетер приклеивали к вене с помощью Vetbond (3M Animal Care Products, Сент-Пол, Миннесота, США) и зашивали разрезы на спине и шее. Все животные получали мелоксикам и амоксициллин / клавулановую кислоту периоперационно, как указано выше.

Аппарат для поведенческого тестирования и парадигмы

Во всех парадигмах, за исключением теста на вторжение человека, животных обучали входить в прозрачный ящик для переноски из плексигласа (240 × 230 × 200 мм), в котором их переносили в аппарат для поведенческого тестирования. Ящик для переноски имел два круглых окна (диаметром 30 мм) с противоположных сторон. Ящик для переноски Perspex был помещен внутрь испытательной камеры, и мартышка оставалась внутри этого ящика во время тестирования.

По практическим причинам, касающимся ограничений на испытательную аппаратуру, поведенческий порядок тестов не был уравновешен: все животные перешли от тестирования в нейтральных условиях к условной парадигме угрозы и вымирания и к аверсивному тесту Павлова на дискриминацию с человеком-вторгшимся. тест проводится параллельно.Для каждой поведенческой парадигмы всегда проводилась контрольная инфузия внутри субъекта, и во всех случаях во время контрольной инфузии животные демонстрировали соответствующие поведенческие и сердечно-сосудистые реакции, ожидаемые в каждой парадигме.

Нейтральное состояние

В нейтральном состоянии мартышек помещали в сделанную на заказ звукоизолирующую испытательную камеру с включенным освещением. Первоначальные сеансы длились 5 минут, а их продолжительность увеличивалась до 20 минут в течение 5-7 дней.Считалось, что животные привыкли, когда частота сердечных сокращений достигла стабильного уровня в течение двух дней (средняя частота сердечных сокращений в пределах ± 10%) и когда животные демонстрировали расслабленную, неподвижную и не бдительную позу. Общее количество сеансов привыкания зависело от скорости акклиматизации отдельного животного к устройству (среднее значение ± SEM количество сеансов: 25 ± 6).

Павловские условные испытания на угрозу и исчезновение

Павловские условные испытания на угрозу и исчезновение проводились в специально изготовленной испытательной камере.Одна стена камеры состояла из переключаемого стекла SmartGlass (SmartGlass International®, Дублин, Ирландия). При подаче напряжения прозрачность панели SmartGlass изменяется с непрозрачной на прозрачную. Когда SmartGlass прозрачен, он открывает дополнительную секцию испытательной камеры. Резиновая змея (US +) была помещена в эту камеру только для конкретных испытаний сеанса сбора данных.

Единый блок парадигмы условной угрозы и вымирания состоял из пяти сеансов, проводимых в течение пяти последовательных дней (приложение к рис.S1):

• Сеансы 1–2 (привыкание) — животные были приучены к 12 попыткам (межпробный интервал (ITI) 110–130 с) освещения SmartGlass в течение 5 с, чтобы показать пустую дополнительную камеру (безусловный стимул -; US-).

• Сессия 3 (сбор данных) — Обусловленные стимулы (CS) были представлены в виде звуковых сигналов в течение 15 секунд, 70 дБ. Каждое из девяти испытаний состояло из 15-секундной CS и 5-секундной US (ITI 160–180 с).CS сохранялись в течение 5 секунд США, чтобы совместно завершить работу с США. Первые три презентации CS были сопряжены с презентациями US-. Последние шесть CS были спарены с US + (стекло стало прозрачным, чтобы обнажить резиновую змею в дополнительной камере).

• Сессия 4 (вымирание) — Каждое из десяти испытаний состояло из 15-секундного CS, за которым следовали US- (ITI 60–80 с). Инфузии контроля или сверхактивации проводили непосредственно перед сеансом угасания, чтобы определить эффекты активации sgACC / 25 на экспрессию и угасание условной угрозы.

• Сессия 5 (отзыв о вымирании) — Десять испытаний CS / US (ITI 70–110 с), идентичных вымиранию, были представлены для проверки отзыва об угрозе исчезновения.

Три блока по пять сессий были повторены для каждого испытуемого с недельным перерывом между блоками. Они включали два контрольных блока физиологического раствора и один блок сверхактивации. Первый блок (всегда физиологический раствор) использовался в качестве базового блока — сеансы привыкания этого блока не были сопоставимы со вторым и третьим блоками, потому что животное никогда не испытывало отвращение змеи в камере.Второй и третий блоки использовались при анализе данных, и манипуляции с контролем и чрезмерной активацией уравновешивались внутри этих блоков. Чтобы свести к минимуму обобщение угроз между блоками, были введены отдельные узорчатые стеновые панели, чтобы варьировать контекст, и различные слуховые сигналы использовались в качестве CS.

Четыре из семи мартышек были протестированы по Павловскому условному тесту угрозы и исчезновения; трое сразу перешли на аверсивный Павловский дискриминантный тест, следуя нейтральному условию.Из этих трех графиков тестирования двух мартышек были ускорены из-за SARS-CoV-2, в то время как одна мартышка не смогла проявить достаточную реактивность на змею US.

Аверсивный дискриминантный тест по Павлову и ПЭТ-сканирование

Во время аверсивного Павловского дискриминантного теста кондиционирования семь мартышек сначала подверглись воздействию двух новых слуховых сигналов (20 с), и была измерена реакция артериального давления. Затем реплики уравновешивались таким образом, что реплика, вызывающая наименьшую реакцию возбуждения, становилась CS +, а реплика, вызывающая наибольшую реакцию возбуждения, становилась CS-.Затем животных обучали аверсивной парадигме павловской дискриминации (Приложение к рис. S4): CS + был связан с аверсивным US +, состоящим из 30 секунд темноты, с 10 секундами белого шума 85 дБ, псевдослучайно представленными в первом, вторая или третья 10 секунд темноты. CS- был связан с нейтральным тоном 2 кГц (США) 0,5 с 80 дБ. CS завершились совместно с соответствующими US. ITI варьировались псевдослучайно от 100 до 160 с. Каждый сеанс состоял из двух-четырех испытаний с не более чем одним испытанием CS + / US + в одном сеансе.Инфузии всегда проводились на сеансах с пробной структурой CS- / CS + / CS-.

Семи мартышкам был имплантирован подкожный порт для ПЭТ-сканирования, но только четыре были просканированы из-за отказа одного датчика телеметрии, блокировки одного порта и остановки сканирования одной мартышки из-за SARS-CoV-2. Четыре мартышки, подвергшиеся ПЭТ-сканированию ¹⁸ F-FDG, были протестированы на удлиненной версии аверсивного теста на дискриминацию по Павлову. Продолжительность сеанса была увеличена с 500 до 1800 с, чтобы способствовать нарушению церебрального захвата ¹⁸ F-FDG поведенческой парадигмой.Привыкание к этим расширенным сеансам тестирования происходило в течение десяти сеансов с использованием той же структуры исследования, что и выше, за исключением удлиненных ITI (330–440 с). Во время обучения мартышек также приучали ко всем процедурам обращения с ними в день сканирования, включая имитацию инъекций и инфузий, но исключая введение анестезии. Тестирование этого удлиненного теста аверсивной дискриминации проводилось каждый день до последнего сканирования (за исключением дней восстановления после операции по имплантации порта или сканирования).

Поведенческий тест в дни ПЭТ-сканирования представлял собой уникальную версию удлиненного теста кондиционирования, состоящего из трех типов испытаний в течение 30-минутного сеанса: два испытания CS- / US-, четыре испытания CS + / US + и два испытания с зондом. Последний состоял из стандартного 20-секундного CS +, но не US +, чтобы ограничить аверсивные воздействия за один сеанс тестирования. Порядок представления CS детализирован на рис. 5a, ITI составляет 130–180 с.

Тест на проникновение человека (HI)

Тест на HI проводился в домашней клетке мартышек.Во время сеансов тестирования животные были разделены в правом верхнем квадранте клетки от их товарища по клетке. После 8 мин привыкания к разлуке в комнату вошел незнакомый злоумышленник. Злоумышленник был одет в разные латексные маски, чтобы скрыть лицо. Злоумышленник стоял в 40 см от передней части клетки и сохранял зрительный контакт с мартышкой в ​​течение 2 мин. Поведение записывалось с помощью видеокамеры (GoPro 5, США) и микрофона (Sennheiser MKE 400, Германия). После вторжения животных регистрировали еще в течение 5 мин.Порядок латексных масок был сбалансированным, и между каждым сеансом был интервал не менее 1 недели.

Медикаментозное лечение

При всех стерильных лекарственных препаратах мартышек осторожно держал помощник, знакомый животному, пока исследователь вводил лекарство. Для центральных инфузий колпачки и блокаторы канюли были удалены с направляющей, а место было очищено 70% изопропиловым спиртом. В направляющую вставляли стерильный инжектор (Plastics One, Роанок, Вирджиния, США), подключенный к газонепроницаемому шприцу объемом 2 мкл в шприцевом насосе.Длина инжектора определялась глубиной кортикального слоя и размещением направляющих канюль во время операции. Двусторонние инфузии проводились в течение 2 минут со скоростью 0,5 мкл / мин, при этом инжектор оставался на месте еще на минуту, чтобы позволить лекарству диффундировать перед удалением инжектора. Стерильные блокираторы канюль и колпачки были заменены, и мартышка была возвращена в клетку на 10 мин. Для внутримышечных инъекций кетамина место инъекции, расположенное на боковой поверхности бедра, очищали спиртом и вводили 0.5 мг / кг кетамина или равный объем физиологического раствора перед тестированием. См. Таблицу S2, где приведены сведения о времени и дозах препаратов, использованных в этой рукописи.

ПЭТ-визуализация

Каждая мартышка, подвергавшаяся ПЭТ-сканированию, получила два ПЭТ-сканирования ¹⁸ F-FDG с помощью сканера microPET Focus-220 (Concorde Microsystems, Ноксвилл, Теннесси, США) с первым сканированием ~ через 2 недели после операции по имплантации порта и интервал между сканированиями ~ 2 недели. В день сканирования животные не получали завтрак, чтобы снизить концентрацию глюкозы в крови и, следовательно, увеличить транспорт ¹⁸ F-FDG в ткань мозга, тем самым увеличив отношение сигнала ¹⁸ F-FDG к шуму.Мартышка получала инфузию физиологического раствора или DHK за 10 минут до болюсной инъекции ~ 70 МБк ¹⁸ F-FDG, вводимой подкожно через порт для доступа к сосуду. Затем их поместили в испытательную установку, и после описанной выше поведенческой парадигмы мартышку подвергли наркозу. Затем мартышку поместили на грелку на станине сканера и прикрепили к оборудованию для мониторинга. Частота сердечных сокращений, SpO ₂ и частота дыхания контролировались непрерывно.Кровать сканера была расположена так, чтобы мозг находился в центре поля зрения ПЭТ-сканера, где и чувствительность, и разрешение являются оптимальными. Для единообразия сбор данных ПЭТ начался через 70 минут после инъекции ¹⁸ F-FDG и продолжался 45 минут. Используемые временные окна по энергии и совпадению составляли 350–650 кэВ и 6 нс соответственно.

Данные ПЭТ в режиме списка были преобразованы в гистограмму в четырехмерные синограммы 9 × 5 мин, а затем реконструированы с использованием ребининга Фурье (FORE ⁵³ ), за которым следует алгоритм максимизации ожидания двумерных упорядоченных подмножеств (OSEM), установленный на сканере ( 6 итераций, 16 подмножеств).Поскольку сканирование передачи после инъекции было невозможным, для коррекции ослабления использовалось скорректированное на среднее без ослабления изображение ¹⁸ F-FDG для определения контура тела, в пределах которого был приписан равномерный коэффициент ослабления (0,096 см ^-1 ). Это было объединено со стандартной картой ослабления слоя углеродного волокна, определенной при сканировании передачи. Комбинированная карта затухания проецировалась вперед с использованием программного обеспечения, установленного на сканере, для получения синограммы коэффициента поправки затухания, и реконструкция изображения была повторена с применением поправки затухания.Также были внесены поправки на случайные совпадения, мертвое время, нормализацию, разброс, чувствительность и затухание.

Отбор проб кортизола в слюне

Образцы кортизола в слюне были собраны в аффективно нейтральном состоянии (для измерения базального уровня кортизола) и в сеансах накопления и угасания в рамках Павловского условного теста угрозы и исчезновения (для измерения динамики кортизола в неблагоприятных условиях). Образец кортизола из слюны был взят во время инфузии в качестве «предварительного» образца перед сеансом тестирования, а второй «пост» образец был взят после тестирования.Образцы слюны брали, помещая стерильную ватную палочку в рот мартышки и вращая ее в течение 5–15 с, чтобы впитать достаточное количество слюны. Затем образцы помещали в стерильные пробирки и хранили в морозильной камере -20 ° C до обработки. Образцы были проанализированы внешним методом иммуноанализа в Core Biochemical Assay Laboratory (CBAL) в больнице Адденбрукса (Кембридж, Великобритания). Образцы кортизола в слюне были взяты в одно и то же время дня у всех животных (~ 11 и 11:30 утра) для контроля циркадного ритма кортизола ⁵⁴ .В нейтральных условиях у четырех мартышек был измерен уровень кортизола, но в одном образце было недостаточно слюны, в результате чего размер выборки составил три (рис. 2h). В парадигме условной угрозы и исчезновения у всех четырех мартышек были измерения кортизола в слюне во время приобретения и исчезновения.

Посмертная гистологическая обработка

Животных предварительно обработали лекарственными средствами гидрохлоридом кетамина перед умерщвлением пентобарбиталом натрия (20 мг / 1 мл; Merial Animal Health, Эссекс, Великобритания).Затем животных перфузировали транскардиально 300 мл 0,1 М PBS, а затем 300 мл 4% фиксирующего раствора параформальдегида в течение ~ 15 мин. Головной мозг удаляли и оставляли в 4% растворе фиксатора параформальдегида на ночь перед переносом в 0,01 М раствор PBS-азида на не менее 48 часов. Наконец, мозг переводили в 30% раствор сахарозы на срок не менее 48 часов для криозащиты. Затем мозг делали на замораживающем микротоме (коронарные срезы толщиной 40–60 мкм), помещали на предметные стекла и окрашивали крезил-фиолетовым.Срезы просматривали под световым микроскопом (Leitz DMRD, Leica Microsystems, Германия). Расположение канюли для каждого животного схематизировали на чертежах стандартных корональных срезов мозга мартышки (рис. 1e).

Сбор данных и статистический анализ

Для анализа все данные были введены в GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Ла-Холла, Калифорния, США), IBM SPSS Statistics v25.0 для Macintosh (IBM, США) и Microsoft Excel v16. 37 для Macintosh (Microsoft, США). Значимость была установлена ​​на α = 0.05 во всех случаях. В случае всего дисперсионного анализа (ANOVA) множественные сравнения были рассчитаны с использованием теста множественных сравнений Сидака. Величины эффекта представлены как d Коэна для t -тестов, апостериорных тестов и линейных моделей или η ² для ANOVA. * обозначает p <0,05, ** обозначает p <0,01 и *** обозначает p <0,001 на всех фигурах.

Сбор и предварительный анализ телеметрических данных: данные об артериальном давлении непрерывно передавались имплантированным телеметрическим датчиком в приемник для автономного анализа с помощью Spike2 (версия 8.11a, CED, Кембридж, Великобритания). Любые выбросы и ошибки записи в данных были удалены (значения выше 200 мм рт. Ст. Или ниже 0 мм рт. Ст. Или другие аномальные всплески). Сбор данных в целом был надежным, но пропуски данных менее 0,4 с были заменены интерполяцией кубическим сплайном, а пропуски более 0,4 с считались пропущенными значениями. События систолического артериального давления (сАД) были извлечены как локальные максимумы из каждого сердечного цикла, а события диастолического артериального давления (ДАД) извлечены как локальные минимумы. Частоту сердечных сокращений рассчитывали с использованием временного интервала между соседними максимумами.САД рассчитывалось по соседним значениям систолического и диастолического давления по формуле САД = дБП + 1/3 (сАД — дБП).

Нейтральное состояние: В нейтральном состоянии были собраны данные об артериальном давлении, частоте сердечных сокращений и вариабельности сердечного ритма (ВСР). Для сеансов инфузии данные анализировались в течение 1–10 минут, когда все животные казались спокойными по поведенческим и сердечно-сосудистым показаниям. 0-я минута была исключена, чтобы дать время для акклиматизации к аппарату после транспортировки. Основными сердечно-сосудистыми показателями были артериальное давление, частота сердечных сокращений и ВСР.ВСР количественно оценивали с помощью среднеквадратичных различий последовательных интервалов R-R (RMSSD). Индексы симпатической и парасимпатической активности, называемые сердечным симпатическим индексом (CSI) и сердечным вагусным индексом (CVI), также рассчитывались, как описано в ссылке. ⁵⁵ .

sgACC / 25 сравнивалась с инфузиями физиологического раствора по отдельным показателям сердечно-сосудистой системы с использованием двусторонних парных тестов t . Посекундные значения частоты сердечных сокращений сравнивались с использованием линейной смешанной модели со временем (в интервале в одну секунду) и манипуляциями (контроль, чрезмерная активация) в качестве факторов.

Во всех последующих тестах артериальное давление использовалось в качестве основного показателя сердечно-сосудистой системы по двум причинам: во-первых, в обоих Павловских тестах кондиционирования кондиционирование артериального давления было более постоянным по сравнению с частотой сердечных сокращений. Во-вторых, чрезмерная активация sgACC / 25 не влияла на артериальное давление в аффективно нейтральном состоянии, тогда как любые изменения в значениях частоты сердечных сокращений были бы искажены исходным сердечно-сосудистым эффектом. Единственный случай, когда использовались значения частоты сердечных сокращений, был в парадигме кондиционирования ПЭТ, где ответы были более последовательными, чем артериальное давление.

Павловский условный тест на угрозу и исчезновение: поведение во время периодов CS оценивалось в автономном режиме по видеозаписям сеанса. Оцениваемое поведение представляло собой бдительное сканирование (VS) — внимательное сканирование окружающей среды, сопровождаемое напряженной позой тела ^17,56,57 . Измерения VS были усреднены по парам CS (как описано в ссылке ⁵⁸ ). Также был рассчитан VS, управляемый CS (VS _{, период CS} — VS _{, базовый уровень} , где базовый уровень — 15 с до CS), что действительно показало свидетельство специфического обучения CS (приложение к рис.S2C). Однако для согласованности с сердечно-сосудистыми показателями (см. Ниже) для анализа использовались абсолютные значения VS.

Средние значения артериального давления были рассчитаны и усреднены в парах CS, как указано выше. Реакции артериального давления были нормализованы (с использованием меры разницы) к средней реакции артериального давления в течение двух сеансов привыкания в пределах блока (с учетом возбуждения в контексте и индивидуальных различий в абсолютном артериальном давлении). Также были рассчитаны и усреднены по парам CS-направленные ответы артериального давления, но последовательные CS-направленные ответы артериального давления не были очевидны (Рис.S2D), поэтому для анализа использовались абсолютные значения артериального давления.

Чтобы определить, было ли какое-либо различие в профилях сбора данных во время блоков «быть управляемым» и «быть сверхактивным», абсолютное артериальное давление и абсолютные значения VS последней пары CS перед захватом сравнивались с окончательными пара CS после сбора данных по обоим блокам с использованием двухстороннего дисперсионного анализа с повторными измерениями в форме M ₂ × P ₂ : M — это фактор с двумя уровнями (манипуляция), а P — это фактор с двумя уровнями (манипуляция). фактор с двумя уровнями (пара CS; до vs .после приобретения). «Пост»: «до» соотношения кортизола в слюне также рассчитывались для каждого блока сбора данных (четыре субъекта, по два блока каждый, всего восемь блоков). Эти соотношения сравнивали с гипотетическим значением 1,0 (без изменений) с использованием теста t для одного образца, чтобы определить, значительно ли повышается уровень кортизола в слюне.

Абсолютные значения VS и артериального давления во время пар CS фаз исчезновения и исчезновения воспоминаний были проанализированы с использованием отдельных двусторонних дисперсионных анализов с повторными измерениями в форме M ₂ × P ₅ , где M — фактор с двумя уровнями (манипуляция), а P — фактор с пятью уровнями (пара CS).Дальнейший анализ был направлен на определение наличия общего эффекта чрезмерной активации sgACC / 25 на кровяное давление или значения VS во время сеансов восстановления / исчезновения. Для артериального давления это было сделано путем сравнения профилей артериального давления на протяжении всего сеанса восстановления / исчезновения (за исключением первой минуты) с использованием линейной смешанной модели со временем (в интервале в одну секунду) и манипуляциями (контроль / чрезмерная активация). как факторы. Для VS это было сделано путем измерения базовых (15 с до CS) значений VS в сеансах отзыва / исчезновения и сравнения значений между контролем и условиями чрезмерной активации с использованием двустороннего парного теста t .

Аверсивный дискриминантный тест по Павлову: оцениваемое поведение было VS во время CS и базового периодов, а CS ориентированные значения VS были рассчитаны как CS минус базовый уровень, как указано выше. Показатели сердечно-сосудистой системы представляли собой средние значения артериального давления в течение 20-секундного базового периода, 20-секундного CS и 30-секундного US + периодов. Были рассчитаны как направленные CS, так и направленные US (MAP _{, период} , США — MAP _{, период CS} ) реакции артериального давления. В отличие от теста условной угрозы и угасания, CS-направленное кондиционирование было очевидным как для VS, так и для артериального давления в этой парадигме, и эти меры использовались в анализе.Период 10 секунд после прекращения US + был определен как период восстановления — этот период представляет априорный интерес, поскольку нарушенное восстановление после стресса является ключевым признаком психических расстройств. ⁵⁹ .

Чтобы проиллюстрировать успешное различение между CS + и CS-, был проведен однофакторный ANOVA с повторными измерениями, сравнивающий сердечно-сосудистые и поведенческие реакции на каждое испытание на сеансе CS- / CS + / CS- непосредственно перед инфузиями. Чтобы продемонстрировать реакцию на US +, ответные реакции артериального давления, направленные на УЗИ, сравнивали с гипотетическим значением 0 (без изменений по сравнению с периодом CS) с использованием теста t для одной выборки.

Для манипуляций с лекарственными препаратами сначала определяли, были ли какие-либо различия в ответах на CS-направленный VS и артериальное давление, используя двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями в форме M ₂ × C ₃ , где M — это фактор с двумя уровнями (манипуляция), а C — это фактор с тремя уровнями (тип CS: CS- ₁ , CS + или CS- ₂ ). Дальнейший анализ был направлен на определение наличия общего эффекта чрезмерной активации sgACC / 25 на абсолютные значения VS или артериального давления в течение исходного периода.Абсолютные значения VS и артериального давления сравнивались для разных типов инфузии с использованием отдельных двухфакторных дисперсионных анализов с повторными измерениями в форме M ₂ × B ₃ , где M — коэффициент с двумя уровнями (тип манипуляции) и B — это фактор с тремя уровнями (базовый тип: первый, второй или третий).

В течение 10-секундного периода восстановления после US + были рассчитаны соотношения, сравнивая значение артериального давления в каждую секунду со значением артериального давления в последнюю секунду периода US +.Значения отношения для условий контроля и сверхактивации сравнивались с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями в форме M ₂ × T ₁₀ , где M — коэффициент с двумя уровнями (тип манипуляции) и T — это коэффициент с десятью уровнями (десять временных интервалов по 1 с).

Для модифицированного дискриминативного кондиционирования для ПЭТ-сканирования сердечно-сосудистые и поведенческие переменные были проанализированы по CS, US и исходным периодам для всех испытаний, аналогично стандартному тесту аверсивной дискриминации.Средние данные, ориентированные на CS, были проанализированы с использованием двухстороннего дисперсионного анализа с повторными измерениями в форме M ₂ × C ₃ , где M — это фактор с двумя уровнями (тип манипуляции), а C — это фактор с двумя уровнями (тип манипуляции). фактор с тремя уровнями (тип CS: CS-, CS + и зонд).

Тест человека-злоумышленника (HI): программа поведенческого анализа (JWatcher v1.0, Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе и Университет Маккуори) использовалась для оценки поведения во время фазы вторжения. Оценивались следующие показатели: время, проведенное перед клеткой (TSAF), время, проведенное позади клетки (TSAB), средняя высота, средняя глубина, подпрыгивание (быстрые движения тела из стороны в сторону), прыжки, передвижение. и вокализации (крики яиц, крики яиц, крики яиц и крики яиц).Используя исследовательский факторный анализ (EFA) с методом факторизации по главной оси, поведение было загружено в один латентный фактор, представляющий тревожно-подобное поведение (с весами, показанными на рис. 5b; подробное описание см. В ссылке ²⁹ ). После того, как для каждого сеанса HI были рассчитаны оценки тревожности, полученные из EFA, был проведен однофакторный анализ ANOVA с повторными измерениями для сравнения эффектов контроля, сверхактивации и манипуляций [сверхактивация + кетамин] на оценки тревожности.

Эффекты кетамина изучались только в тесте HI из-за ограничений на количество инфузий, которые может получить каждое животное, и временных ограничений на общую продолжительность исследования.

ПЭТ-сканирование: магнитно-резонансная (МРТ) визуализация животных была невозможна из-за имплантированных в мозг канюль, что препятствовало использованию пространственной нормализации на основе МРТ. Вместо этого сначала среднее ПЭТ-изображение 18F-FDG для каждого сканирования было вручную жестко зарегистрировано в шаблоне мозга 18F-FDG PET, полученном в другом исследовании 18F-FDG PET в колонии, которое включало МРТ.Шаблон мозга ПЭТ 18F-FDG был построен путем усреднения n = 21 ПЭТ-изображений 18F-FDG, преобразованных в пространство шаблона с использованием преобразований регистрации, полученных путем деформации МР-изображений (совместно зарегистрированных с ПЭТ-изображениями 18F-FDG) в МР-шаблон. Во-вторых, для каждого субъекта были усреднены два сканирования ПЭТ 18F-FDG, жестко зарегистрированных в шаблоне ПЭТ 18F-FDG, полученное изображение было нежестко зарегистрировано (аффинно и нелинейно) на шаблоне ПЭТ 18F-FDG с использованием ANTS ⁶⁰ , и это преобразование было применено к каждому из трех жестко зарегистрированных ПЭТ-сканирований 18F-FDG.Использование одного преобразования пространственной нормализации для каждого субъекта, а не для ПЭТ-сканирования 18F-FDG было принято после того, как было обнаружено — с помощью ПЭТ-сканирований n = 21 18F-FDG с МРТ — что этот подход обеспечивает ПЭТ области интереса (ROI). значения с более высокой корреляцией с теми, которые получены с помощью пространственной нормализации на основе MR ( R ² = 0,89 по сравнению с R ² = 0,87).

Для каждого сканирования была создана карта SUVR для воксельного анализа путем деления среднего ПЭТ-изображения на значение ROI мозжечка.Нормализация сигналом мозжечка была разработана, чтобы минимизировать мешающее влияние различий между сканированиями в доступности индикатора; концентрация глюкозы в плазме; влияние анестезии на мозговой кровоток и обмен веществ; и базальный церебральный метаболизм глюкозы.

SPM8 (Wellcome Trust Institute for Neurology, UCL, UK) использовался для воксельного анализа. Общая линейная модель была сконфигурирована с ковариатами для субъекта и состояния (контроль физиологического раствора против чрезмерной активации), и изменения активности были протестированы с помощью теста Стьюдента t на каждом вокселе.Перед оценкой модели изображения были сглажены с размером фильтра 1 мм ³ с использованием локально адаптированного ядра Гаусса для включения только тех вокселей внутри маски мозга. Из-за небольшого числа субъектов, присущих инвазивным исследованиям на приматах, результаты трудно выдержать консервативные поправки для множественных сравнений. Чтобы обеспечить исследовательский анализ с некоторым смягчением против ошибок типа I, скорректированный нескорректированный порог p <0,005 использовался в сочетании с небольшим порогом протяженности в пять вокселей для удаления неправдоподобных кластеров из статистических карт.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Сплайсинг резидентных тромбоцитов пре-мРНК после активации физиологическими стимулами приводит к функционально значимым модификациям протеома

Очистка и активация тромбоцитов

В исследование были включены пятнадцать здоровых добровольцев (все мужчины без факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний), которые воздерживались от приема каких-либо лекарств .Письменное информированное согласие было получено от каждого субъекта. Протокол был одобрен местным этическим комитетом Университета Кампании «Луиджи Ванвителли», и все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими директивами и правилами. По 50 мл крови от каждого донора собирали в пробирки с цитратом натрия 0,105 М (1:10 об / об) и обрабатывали в течение 15 минут после отбора пробы. Для выделения тромбоцитов образцы крови центрифугировали при 160 × g в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученную богатую тромбоцитами плазму затем фильтровали с использованием специальной системы удаления лейкоцитов (Pure Cell PALL, Pall Italia), как описано ранее ¹³ .Загрязнение лейкоцитами оценивали с помощью проточной цитометрии и анализа rtPCR мРНК специфического антигена лейкоцитов (CD-45) и тромбоцитов (CD-41) с использованием РНК GAPDH в качестве контроля, как описано в разделе «Дополнительная информация» (раздел «Методы»). Очищенные тромбоциты от каждого донора разделяли на три аликвоты: первую аликвоту немедленно обрабатывали и использовали в качестве контроля (исходный уровень: T0), две аликвоты обрабатывали коллагеном (COLL, 60 мкг / мл) или пептидом, активирующим тромбиновый рецептор (TRAP 25 мкМ). ) при непрерывном перемешивании в течение 120 минут при 37 ° C перед обработкой.Агрегация тромбоцитов была проверена во всех образцах до и после стимуляции путем образования макроагрегатов и подтверждена агрегометрией светопропускания, как описано в разделе «Дополнительная информация» (раздел «Методы»). После двух часов стимуляции тромбоциты центрифугировали при 2000 × g при 4 ° C, трижды промывали PBS и затем хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки.

Экстракция РНК и белка

Очищенные тромбоциты от каждого из 15 доноров подвергали экстракции тотальной РНК и белка с использованием набора mirVana PARIS (Thermofisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.600 мкл ледяного буфера для разрушения из набора добавляли к каждой аликвоте тромбоцитов (15 доноров) и получали 3 пула по 5 образцов в каждом. Одна треть каждого пула отбиралась для экстракции белка, как описано в ¹³ , а оставшаяся часть обрабатывалась для очистки РНК, как описано ранее ¹³ . Концентрацию РНК в каждом образце анализировали с помощью спектрофотометра ND-2000c (Thermo Scientific), а ее качество и целостность оценивали с помощью биоанализатора Agilent 2100 с комплектом Agilent RNA 6000 pico (Agilent Technologies).Концентрацию белка определяли с использованием набора Bradford Protein Assay и набора для количественного определения белка EZQ. Три независимых биологических повтора для каждой обработки и CTRL использовали для всех последующих анализов.

Масс-спектрометрия и анализ данных

Подготовка образца

Подготовка образцов белка для анализа MS выполнялась, как описано ранее ²³ . Вкратце, образцы очищали, ресуспендировали и обрабатывали ультразвуком в буфере, содержащем 4% SDS, 25 мМ HEPES pH 7.6 и 1 мМ DTT. Оценивали общее количество белка (Bio-Rad DC). Для подготовки проб с помощью фильтрации 150 мкг образца белка смешивали с 1 мМ DTT, 8 М мочевины, 25 мМ HEPES pH 7,6 в центрифугированном фильтрующем блоке с отсечкой 10 кДа (центрифужные устройства Nanosep® с мембраной Omega ™, 10 л). Затем образцы центрифугировали в течение 15 минут, 14000 g, затем еще раз добавляли 8 М мочевинный буфер и центрифугировали. Белки алкилировали 25 мМ ИУК в 8 М мочевине, 25 мМ HEPES pH 7,6 в течение 10 мин, центрифугировали, затем еще два раза добавляли и центрифугировали с 8 М мочевиной, 25 мМ HEPES pH 7.6. Образцы белка переваривали на фильтре с использованием трипсина (модифицированная степень секвенирования, Promega, соотношение фермент: белок 1:50) в буфере, содержащем 0,25 М мочевину, 50 мМ HEPES, в течение ночи при 37 ° C. После разложения фильтровальные блоки центрифугировали в течение 15 мин, 14000 g, после чего следовало еще одно центрифугирование с водой MilliQ. Пептиды собирали и определяли концентрацию пептидов. Перед маркировкой pH образцов доводили с помощью TEAB pH 8,5 (30 мМ, конечная концентрация). Полученные смеси пептидов метили TMT 10 plex (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя, а затем объединяли.Эффективность маркировки определялась перед объединением с помощью ЖХ-МС / МС путем прогона коротких (15 мин) градиентов всех образцов после маркировки с помощью ВЭЖХ Agilent, соединенной с Velos, прогона с CID и HC, затем данные просматривались в простом рабочем процессе. (SEQUEST, без перколятора) с TMT-мечения, установленным как динамическое, чтобы убедиться, что эффективность мечения была> 99% на уровне PSM. Очистку образцов проводили твердофазной экстракцией (SPE strata-X-C, Phenomenex), и очищенные образцы сушили в SpeedVac.

Изоэлектрическое фокусирование высокого разрешения (HiRIEF)

После очистки пулы образцов были подвергнуты воздействию пептида IEF-IPG (изоэлектрическое фокусирование с помощью иммобилизованного градиента pH) в диапазоне pI 3–10.Высушенные образцы пептидов (300 мкг) растворяли в 160 мкл раствора для регидратации, содержащего 8 М мочевины, и позволяли адсорбироваться на гелевом мостике путем набухания в течение ночи. Полоски IPG с линейным градиентом 24 см (GE Healthcare) инкубировали в течение ночи в 8 М растворе для регидратации, содержащем 1% фармацевтического IPG pH 3–10 (GE Healthcare). Образцы наносили на полоски IPG с помощью гелевого мостика (pH 3,7) на катодном конце и прогоняли, как описано в ^44,45 . После фокусировки пептиды были пассивно элюированы на 72 смежные фракции водой MilliQ с использованием роботизированного экстрактора IPG собственного производства (GE Healthcare Bio- Sciences AB, прототип прибора) в 96-луночный планшет (V-образное дно, продукт Corning № 3894). ), который затем сушили в SpeedVac.Полученные фракции сушили вымораживанием и хранили при -20 ° C.

LC-ESI-MS / MS

Онлайн-ЖХ-МС выполняли с использованием гибридного масс-спектрометра Q-Exactive (Thermo Scientific), подключенного к системе UPLC 3000 (Dionex). Для каждого цикла ЖХ-МС / МС автоматический пробоотборник распределял 8 мкл растворителя А в лунку в планшете 96 В, перемешивал в течение 10 мин и продолжал вводить 3 мкл. За мастер-сканированием FTMS с разрешением 70 000 (и диапазоном масс 300–1700 m / z) следовали зависимые от данных МС / МС (разрешение 17 500) для пяти верхних ионов с использованием более высокой энергии диссоциации столкновений (HCD) при 30% нормализованной энергии столкновения.Прекурсоры выделяли с окном 2 m / z. Целями автоматической регулировки усиления (AGC) были 1e6 для MS1 и 1e5 для MS2. Максимальное время впрыска составляло 100 мс для MS1 и 500 мс для MS2. Полный рабочий цикл длился ~ 2,5 с. Использовалось динамическое исключение продолжительностью 60 с. Прекурсоры с неназначенным зарядовым состоянием или зарядовым состоянием 1 были исключены. Был использован коэффициент недостаточного заполнения 1%.

Идентификация и количественная оценка пептидов и белков

Поиск в исходных файлах MS проводился с использованием SEQUEST, а выходные данные дополнительно уточнялись с помощью Percolator на программной платформе Proteome Discoverer 1.4 (Thermo) против человеческой базы данных Uniprot (

Анализ данных

Для идентификации статистически модулированных белков был применен двухвыборочный t-тест с использованием трансформированного по Log2 медианного значения экспрессии трех биологических повторов COLL и TRAP, обработанных против образцов CTRL с p-значением, вычисленным при перестановке (10000 перестановок) и альфа 0,01 ⁴⁶ . Затем была применена еще одна поправка Бонферрони. Данные по идентификации и количественной оценке белков представлены в дополнительной таблице 1A – D.Анализ вариантов сплайсинга был выполнен с использованием SpliceVista ²⁵ , и результаты представлены в дополнительной таблице 2A, B. Наконец, для идентификации пептида экзон-экзонного соединения был осуществлен протеогеномический подход путем поиска пептидных спектров в индивидуальной базе данных, включая in silico, транслированных пептидных секвенированных стыковочных соединений из сохраненных интронов, обнаруженных с помощью анализа данных общей последовательности РНК в образцах CTRL. Для создания настраиваемой базы данных нуклеотидные последовательности были извлечены с точностью ± 75 п.н. из геномных координат сайтов соединения и транслировались в трех рамках считывания в аминокислотные последовательности.Полученные результаты представлены в дополнительной таблице 6A – C.

Секвенирование РНК и анализ данных

RNA-Seq

Проиндексированные библиотеки получали с использованием 250 нг тотальной РНК в качестве исходного материала с помощью набора для подготовки проб TruSeq Stranded Total RNA Sample Prep Kit (Illumina Inc.). Библиотеки секвенировали (парные концы, 2 × 100 циклов) при концентрации 8 пМ / дорожку на платформе HiSeq2500 (Illumina Inc.) и анализировали, как описано ранее ¹³ .

Анализ данных

Созданные файлы необработанной последовательности (.fastq files) прошли анализ контроля качества с использованием FASTQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), а считанные файлы с проверкой качества были затем согласованы с геномом человека (сборка hg38) с использованием STAR версии 2.5. 0а ⁴⁷ . Дифференциально экспрессируемые транскрипты (Fold-change ≥ | 1,5 |, FDR ≤ 0,05) были идентифицированы как описано ⁴⁸ .

Уровень удерживания интронов (отношение IR) был рассчитан для каждого образца с использованием инструмента IRFinder ²⁶ со стандартными параметрами.IRFinder исключает функции, которые перекрываются с интронами, такие как микроРНК или мяРНК, поскольку они могут затруднить точное измерение истинных уровней интронов.

IR-соотношение рассчитывается следующим образом:

$$ \ frac {intronic \, изобилие} {(интронный \, изобилие + экзон \, сплайс \, изобилие)} $$

Для каждого образца отношение IR, превышающее первый квантиль его распределения, было рассмотрено для дальнейшего анализа. Кроме того, для дальнейшего анализа рассматривались только интроны, показывающие отношение IR по крайней мере в двух из трех биологических повторов.

Статистическая значимость дифференциально сохраняемых интронов среди образцов COLL и TRAP и CTRL оценивалась с применением двухвыборочного t-критерия с 10000 перестановками и с применением порогового значения FDR 0,01.

Функциональный анализ был выполнен с использованием ClueGO ⁴⁹ . График Circos был создан с использованием Clico ⁵⁰ .

Статистический анализ

Эксперименты по протеомике были выполнены в трех биологических повторностях. Поиск в исходных файлах MS производился с помощью программной платформы Proteome Discoverer 1.4 (Thermo) против человеческой базы данных Uniprot и отфильтрован до отсечения 1% FDR. Для идентификации статистически модулированных белков был применен двухвыборочный t-тест с использованием Log2 трансформированного медианного значения экспрессии трех биологических повторностей COLL и TRAP, обработанных по сравнению с образцами CTRL, с p-значением, вычисленным при перестановке (10.000 перестановок) и альфа-порогом 0,01. Затем была применена еще одна поправка Бонферрони. Белки считались дифференциально экспрессируемыми, если они показывали кратность изменения | 1.2 |, Анализ РНК-Seq проводили с использованием трех биологических повторов. Считалось, что РНК экспрессируются, когда они были обнаружены со значением экспрессии ≥10 считываний. Дифференциально экспрессируемые РНК были рассчитаны с использованием DESeq2 ⁵¹ с учетом отсечения кратного изменения | 1.5 | и FDR ≤ 0,05. Для анализа удержания интронов интрон считался сохраненным со значением экспрессии выше первого квантиля уровня распределения экспрессии для рассматриваемого набора данных / репликации, и если он сохранялся по крайней мере в двух / трех повторах.Для определения дифференциально удерживаемых интронов применялся двухвыборочный t-критерий. p-значение было вычислено при перестановке (10.000 перестановок) с альфа-отсечкой 0,01. Затем была применена еще одна поправка Бонферрони. Для анализа онтологии генов учитывались только функциональные категории с FDR ≤ 0,05. Для анализов IPA в качестве фона использовали только экспрессированные гены (обнаруженные с помощью R NA-Seq) в тромбоцитах.

Коды доступа

Необработанные данные MS были депонированы в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE ⁵² с идентификатором набора данных PXD006559.Необработанные данные RNA-Seq доступны в EBI ArrayExpress под номером доступа E-MTAB-6148.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

О блокировке активации на Apple Watch

Find My включает функцию блокировки активации, которая предназначена для предотвращения использования ваших Apple Watch посторонними лицами, если они когда-либо были потеряны или украдены.

«Найти меня» и «Блокировка активации» для Apple Watch включается автоматически при настройке «Найти iPhone» на сопряженном iPhone.При использовании блокировки активации ваш Apple ID и пароль потребуются, прежде чем кто-либо сможет это сделать:

• Отключите Apple Watch от iPhone.
• Выполните сопряжение и используйте Apple Watch с новым iPhone.
• Выключите Find My на своем устройстве.

Это поможет защитить ваше устройство, даже если оно находится в чужих руках, и повысит ваши шансы на его восстановление. Даже если вы удалите данные с устройства удаленно, блокировка активации не позволит никому повторно активировать ваше устройство без вашего разрешения.Все, что вам нужно сделать, это включить функцию «Найти меня» и запомнить свой Apple ID и пароль.

Проверьте, включена ли блокировка активации

Выполните следующие действия на сопряженном iPhone, чтобы проверить, включена ли блокировка активации:

1. Откройте приложение Watch на iPhone.
2. Коснитесь вкладки «Мои часы», затем коснитесь «Все часы» вверху экрана.
3. Нажмите кнопку информации рядом с Apple Watch.

Если вы видите «Найти Apple Watch», значит, включена блокировка активации.

Если ваши Apple Watch пропали

Если ваши Apple Watch утеряны или украдены, вы можете использовать функцию «Найти», чтобы помочь вам найти их и защитить свою информацию. Просто войдите в iCloud.ru или приложение Find My, чтобы увидеть пропавшие часы на карте, воспроизвести звук, чтобы помочь вам найти их, заблокировать их в режиме пропажи или удаленно стереть всю вашу личную информацию.

Отключите блокировку активации перед тем, как отправить свои Apple Watch в сервисный центр, продать или отдать

Перед тем, как отправить свои Apple Watch в сервисный центр, продать или отдать их, необходимо отключить блокировку активации на Apple Watch.Просто разорвите пару между Apple Watch и iPhone:

1. Держите Apple Watch рядом с iPhone.
2. Откройте приложение Watch на своем iPhone.
3. Коснитесь вкладки «Мои часы», затем коснитесь «Все часы» вверху экрана.
4. Нажмите кнопку информации рядом с Apple Watch.
5. Нажмите «Разорвать пару с Apple Watch». Для моделей Apple Watch с сотовой связью нажмите «Удалить тарифный план оператора связи». Если вы не собираетесь выполнять сопряжение с другими Apple Watch или iPhone, вам может потребоваться связаться с оператором связи, чтобы отменить подписку на сотовую связь.*
6. Введите свой пароль Apple ID. Если вы забыли пароль Apple ID, его можно сбросить.
7. Нажмите еще раз для подтверждения.

Если вы не можете получить доступ к своему iPhone или Apple Watch, или если Apple Watch не сопряжены с вашим iPhone, и вам необходимо отключить блокировку активации:

1. На компьютере перейдите на iCloud.com и войдите в систему, используя свой Apple ID.
2. Перейти в «Найди мой iPhone».
3. Выберите «Все устройства», затем щелкните Apple Watch.
4. Нажмите «Стереть Apple Watch».Нажимайте «Далее», пока данные с устройства не будут удалены.
5. Нажмите кнопку удаления рядом с Apple Watch.

* Может взиматься комиссия оператора связи. За подробностями обращайтесь к своему оператору.

Дата публикации: 10 февраля 2021 г.

Активация В-клеток и реакция зародышевого центра

Вивиан Тернер, Рослинский институт и Королевская школа ветеринарных наук (Дик), Эдинбургский университет

Активация В-клеток

В-клетки активируются, когда их В-клеточный рецептор (BCR) связывается либо с растворимым, либо с мембраносвязанным антигеном.Это активирует BCR для образования микрокластеров и запуска сигнальных каскадов ниже по течению. Микрокластер в конечном итоге претерпевает фазу сокращения и формирует иммунологический синапс, что позволяет стабильному взаимодействию между В- и Т-клетками обеспечивать двунаправленные сигналы активации.

Однажды активированные В-клетки могут подвергаться рекомбинации со сменой класса. В инактивированном состоянии В-клетки экспрессируют IgM / IgD, но после активации они могут экспрессировать IgA, IgE, IgG или сохранять экспрессию IgM. Они делают это путем удаления нежелательных изотипов (рис. 1).Цитокины, продуцируемые Т-клетками и другими клетками, важны для определения того, какой изотип экспрессируют В-клетки.

Зародышевый центр

B-клетки имеют два основных типа иммунных ответов. При Т-независимом иммунном ответе В-клетки могут отвечать непосредственно на антиген. При Т-зависимом иммунном ответе В-клетки нуждаются в помощи Т-клеток для ответа.

В этой ситуации активированные В-клетки перемещаются к границе зоны Т-клеток, чтобы взаимодействовать с Т-клетками (рис. 2). Лиганд CD40 обнаруживается на этих Т-хелперных клетках и взаимодействует с CD40 на В-клетках, образуя стабильное притяжение.Цитокины, секретируемые Т-клетками, стимулируют пролиферацию и переключение изотипа, а также поддерживают размер зародышевого центра и продолжительность жизни. Без этих сигналов реакция зародышевого центра быстро прекратится.

В-клетки, которые столкнулись с антигеном и начали пролиферировать, могут выйти из фолликула и дифференцироваться в короткоживущие плазматические клетки, называемые плазмобластами (рис. 2). Они секретируют антитела в качестве ранней попытки нейтрализовать чужеродный антиген. Они не выживают более трех дней, но продуцируемые антитела могут оказать важную помощь в остановке быстро делящихся патогенов, таких как вирусы.

Зародышевый центр имеет светлую зону и темную зону. Реакция зародышевого центра начинается в темной зоне, где В-клетки быстро пролиферируют и подвергаются соматической гипермутации. Во время соматической гипермутации случайные мутации генерируются в вариабельных доменах BCR под действием цитидиндезаминазы (AID), индуцированной активацией фермента. Затем В-клетки попадают в светлую зону и конкурируют друг с другом за антиген. Если мутация привела к BCR с улучшенным сродством к антигену, клон В-клетки может превзойти другие клоны и выжить.Также считается, что в светлой зоне В-клетки подвергаются рекомбинации с переключением классов, хотя зародышевый центр не является решающим для этого процесса. B-клетки могут мигрировать между обеими зонами, чтобы пройти несколько раундов соматической гипермутации и рекомбинации с переключением классов. Конечная цель зародышевого центра — продуцировать В-клетки с BCR, которые обладают высоким сродством к исходному антигену.

Плазма и ячейки памяти

В-клетки покидают ответ зародышевого центра в виде высокоаффинных плазматических клеток и В-клеток памяти (рис. 3).Плазматические клетки секретируют антигенсвязывающие антитела в течение недель после активации. Они мигрируют в костный мозг вскоре после образования, где могут находиться неограниченное время, готовые снова встретиться с антигеном и отреагировать. В-клетки памяти циркулируют по всему телу в поисках антигена с высоким сродством к их BCR, а затем быстро реагируют на антиген, останавливая инфекцию. Так работает вакцинация. Поскольку ваше тело ранее подвергалось воздействию антигена, иммунные клетки могут быстро отреагировать и удалить антиген, если он снова встретится, что предотвратит ваше заболевание.

© Авторские права на эту работу принадлежат BSI

Активация инфламмасомы микроглии NLRP3 при лигировании TLR2 и TLR5 с помощью различных сборок α-синуклеина

Ключевые точки

• мономеров и олигомеров α-синуса эффективно активировали инфламмасому NLRP3 через TLR2.

• Активация инфламмасомы NLRP3 нарушила способность клиренса α-син.

• Ингибирование NLRP3 улучшало общий клиренс олигомеров α-син.

Abstract

Болезнь Паркинсона (БП) — второе по распространенности нейродегенеративное заболевание, связанное с возрастом, которое характеризуется образованием внутри нейронов клеточных включений, богатых аномальной формой белка α-синуклеина (α-синуклеин). ). Микроглия — это резидентные иммунные клетки ЦНС, которые реагируют на неправильно свернутые белки посредством лигирования рецептора распознавания образов и активации путей передачи сигналов. Здесь мы изучали активацию первичной микроглии, выделенной от мышей дикого типа, различными формами α-syn и их клиренс.Интернализация α-син-мономеров и олигомеров эффективно активировала пириновый домен NOD-подобного рецептора, содержащий 3 (NLRP3) инфламмасому, посредством лигирования TLR2 и TLR5, тем самым воздействуя на различные контрольные точки передачи сигналов. Мы обнаружили, что первичная микроглия эффективно поглощает α-син, но колеблется в его деградации. Ингибирование NLRP3 селективным ингибитором натриевой солью CRID3 и дефицит NLRP3 улучшали общий клиренс олигомеров α-син. Вместе эти данные показывают, что разные формы α-син проявляют различные свойства активации инфламмасомы микроглии NLRP3, тем самым ставя под угрозу его деградацию, которую можно предотвратить с помощью ингибирования NLRP3.

Сноски

• Эта работа была поддержана Совместной программой ЕС по исследованию нейродегенеративных заболеваний (JPND-SYNACTION-ANR-15-JPWG-0012-03) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (Немецкий исследовательский фонд) в рамках стратегии превосходства Германии EXC2151 -390873048. H.S. получил финансирование от Gemeinnützige Hertie Stiftung (Hertie-Stiftung) в рамках сети передового опыта в области клинической нейробиологии Hertie. R.M. и Л. были поддержаны CNRS, Совместной программой ЕС по исследованию нейродегенеративных заболеваний (JPND-SYNACTION-ANR-15-JPWG-0012-03 и TransPath-ND-ANR-17-JPCD-0002-02) и Фондом исследований. Médicale (Контракт DEQ.20160334896).

• Онлайн-версия статьи содержит дополнительные материалы.

• Получено 26 января 2021 г.
• Принято 15 августа 2021 г.

• Copyright © 2021 Американская ассоциация иммунологов, Inc.

Мембранные нанокластеры FcγRI отделяются от ингибирующего SIRPα при активации человека. макрофаги | Журнал клеточной биологии

Чтобы определить организацию ингибирующего рецептора SIRPα и высокоаффинного Fc-рецептора FcγRI в нанометровом масштабе, мы использовали метод микроскопии сверхразрешения dSTORM.Для этого полученные из моноцитов человека макрофаги (далее называемые первичными макрофагами; фенотипированные на рис. S1A) высевали на предметные стекла, покрытые поли-l-лизином (PLL) (неактивирующие условия), на 10 минут, а затем фиксировали и окрашивали непосредственно меченые моноклональные антитела против SIRPα или против FcγRI (рис. 1). Изображения dSTORM вместе с K-анализом Рипли (Ripley, 1977) клеток, засеянных в неактивирующих условиях, показали, что оба рецептора не распределены случайным образом, а вместо этого организованы в дискретные и пространственно разделенные нанокластеры на поверхности клетки (рис.1, А и Б, вверху).

Затем мы оценили распределение рецепторов, когда клетки высевали на предметные стекла, покрытые человеческим IgG (hIgG), лигандом для FcγR. Эта двухмерная модель фагоцитарного синапса создает плоскую фокальную плоскость, пригодную для dSTORM. Клетки высевали на 10 мин на предметные стекла, покрытые 10 мкг / мл hIgG, а затем фиксировали и окрашивали, как и раньше. После активации FcγR как FcγRI, так и SIRPα были преимущественно организованы в специфические нанокластеры (рис.1, А и Б, внизу).

Чтобы получить количественное представление, мы воссоздали изображения сверхвысокого разрешения в виде карт плотности вероятности молекул на основе одномерного анализа локальных точечных паттернов Гетиса и Франклина (Getis and Franklin, 1987; Williamson et al., 2011). После установления порога карты плотности были преобразованы в бинарные карты, в которых области, содержащие плотные локализации рецепторов, выглядят белыми (называемые нанокластерами; рис.1, А и Б). Количественный анализ показал, что SIRPα конститутивно организован в нанокластеры со средней площадью 7,150 ± 980 нм ² (рис. 1 C), что соответствует радиусу 48 ± 3 нм (при условии, что нанокластеры имеют круглую форму), а средняя плотность составляет 6,4 ± 1 нанокластеров / мкм ² (рис. 1 D). Они стали меньше (5440 ± 1095 нм, ² , радиус 42 ± 4 нм; рис. 1 C) и менее плотными (3,9 ± 1 нанокластеров / мкм ² ; рис. 1 D) после активации посредством FcγRI. Напротив, доля локализаций в нанокластерах (т.е.е. количество локализаций в нанокластерах, деленное на общее количество локализаций) немного увеличилось (в среднем от 64 ± 6% в неактивирующих условиях до 77 ± 7% после активации; Рис. 1 E). FcγRI конститутивно образует более крупные (средняя площадь 15,650 ± 5,030 нм ² , радиус 71 ± 11 нм) и менее плотные (в среднем 2,9 ± 0,3 нанокластера / мкм ² ) нанокластеры, чем SIRPα, содержащие более высокую долю локализаций (среднее 74 ± 7%). Размер (14 610 ± 4030 нм ² , радиус 68 ± 9 нм) нанокластеров FcγRI остался прежним, тогда как их плотность (2.5 ± 0,4 нанокластеров / мкм ² ) уменьшалось при стимуляции hIgG (рис. 1, C и D), а доля локализаций в нанокластерах увеличивалась (82 ± 5%; рис. 1 E). Проточная цитометрия показала снижение средней геометрической интенсивности флуоресценции на 8% и 19% для SIRPα и FcγRI, соответственно, после активации клеток с иммобилизованным на поверхности hIgG в течение 10 минут (рис. S1, B и C), что указывает на небольшую долю оба рецептора интернализуются из интерфейса.

Альтернативный метод анализа, позволяющий отличить кластеризованные от случайно распределенных молекул, основан на преднамеренном изменении плотности маркировки в сочетании с кластерным анализом и нечувствителен к артефактам, возникающим при пересчете мигающих флуорофоров (Baumgart et al., 2016). Чтобы применить это здесь, SIRPα и FcγRI были помечены диапазоном концентраций (0,01–50 мкг / мл) непосредственно меченных антител и визуализированы с помощью dSTORM. Для каждого изображения вычислялась относительная площадь, покрытая масками кластеров (η), полученными из пороговых бинарных карт, и средняя плотность локализаций внутри кластеров (ρ). Как отмечает Баумгарт и др. (2016) подробно обсуждалось, кластерные и случайные распределения можно различить, построив график нормированной плотности ρ / ρ ₀ (где ρ ₀ — пересечение кривых плотности с осью y) в зависимости от η.Для случайно распределенных молекул наблюдается горизонтальная линия, тогда как для кластерных рецепторов наблюдается увеличение ρ / ρ ₀ . Согласно этому анализу, SIRPα и FcγRI группируются на поверхности первичных макрофагов человека, поскольку ρ / ρ ₀ увеличивается, когда концентрация мечения увеличивается (рис. 1, F и G). В целом эти данные показывают, что ингибирующий рецептор SIRPα и высокоаффинный рецептор Fc FcγRI организованы в мембранные нанокластеры на поверхности первичных макрофагов человека до и после активации FcγR.